Tet—onAdvanced调控Amelotin基因表达成釉细胞系的建立

目的应用Tet-OnAdvanced。基因表达系统构建由强力霉素（D0x）诱导Amelotin基因表达的成釉细胞系,为进一步研究Amelotin基因的生物学功能奠定基础。。方法通过fIT—PCT法从出生后7d的小鼠牙胚中克隆得到Amelotin的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight裁体中,利用Tet—onAdvanced基因表达系统先后将调控质粒pTet—OnAdvanced和反应质粒pTRE-Tight-Amelotin转入成釉细胞,分别用G418和潮霉素进行筛选．克隆扩增得到可诱导表达Amelotin基因的成釉细胞系j用RT-PCR法检测不同Dox浓度下转染成釉细胞中Amelotin基因的表达。结果连续两个回合的转染及筛选后获得了引入pTet-onAdvanced系统的细胞系,能够高诱导低背景表达Amelotin,在强力霉素诱导48h可从使Amelotin的表达显著增加,强力霉素在一定浓度范围内可以诱导Amelotin的表达呈剂量依赖性增加。结论成功构建了受强力霉素调控的双重稳定表达Amelotin．成釉细胞系,为进一步研究Amelotin与釉质矿化之间的关系奠定了基础。     

定量诱导表达PRDM1永久细胞系的建立

目的建立可定量诱导表达PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能创建平台。方法将野生型PRDM1基因的cDNA全长克隆到pMEP4表达质粒中,电穿孔法将pMEP4-PRDM1瞬时转染到细胞系SALT3,经潮霉素B筛选后挑选可增殖的单克隆细胞并大量扩增,在不同浓度的硫酸镉（CdSO4）诱导下检测PRDM1蛋白的表达状况。结果成功构建了pMEP4-PRDM1表达载体,在最佳电穿孔条件下将其转染到SALT3细胞,经潮霉素B筛选后扩增出6个细胞克隆。CdSO4诱导后运用免疫印迹法验证了PRDM1蛋白的表达与诱导剂CdSO4存在量效关系。结论运用pMEP4载体可建立定量诱导表达目的基因PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能奠定了基础。     

Photofrin-Diomed 630-PDT对人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC的抑制研究

目的 探讨肿瘤细胞对光动力的敏感度,同时为体外细胞培养的光动力实验研究选择最佳光剂量和最佳光密度提供实验依据.方法 将人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC分别随机分成21组,接种24 h贴壁后,在30μg/ml的光敏剂photofrin-Ⅱ溶液中孵育150 min后,在15 min内应用Diomed-630型激光仪给予25 mW/cm2,50 mW/cm2、100 mw/cm2 3个功率密度分别照射10,20,30,50,100,150,200 s,然后继续培养24 h,应用缩胆囊胆素八肽(CCK-8)法检测两个细胞系的存活率.结果 在photofrin-Ⅱ 30 μg/ml浓度条件下,相同功率密度的光动力疗法(PDT)对细胞系SHEE和SHEEC的抑制率无显著性差异;在photofrin-Ⅱ 30μg/ml浓度条件下,随着光剂量的增加PDT对细胞系SHEE和SHEEC的抑制率呈增加趋势,达到2.5～3.0 J/cm2后进入平台期.结论 人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC对光动力的敏感度无显著性差异,提示肿瘤光动力治疗的靶向作用可能与肿瘤细胞对激光的敏感性无关.     

Screening for genes associated with ovarian cancer prognosis

Background Human epithelial ovarian cancer cell line SKOV3.ipl is more invasive and metastatic compared with its parental line SKOV3. A total of 17 000 human genome complementary DNA microarrays were used to compare the gene expression patterns of the two cell lines. Based on this, the gene expression profiles of 22 patients with ovarian cancer were analyzed by cDNA microarray, and screened the 2-fold differentially expressed genes compared with the normal ones. We screened genes relevant to clinical prognosis of serous ovarian cancer by determining the expression profiles of ovarian cancer genes to investigate cell receptor and immunity-associated genes, and as groundwork, identify ovarian cancer-associated antigens at the gene level.
Methods Total RNA was extracted from 22 patients with ovarian cancer and DNA microarrays were prepared. After scanning, hybridization signals were collected and the genes that were differentially expressed twice as compared with the normal ones were screened.
Results We screened 236 genes relevant to the prognosis of ovarian cancer from the 17 000 human genome cDNA microarrays. According to gene classification, 48 of the 236 genes were cell receptor or immunity-associated genes, including 2 genes related to the International Federation of Gynecology and Obstetrics （FIGO） stage, 4 genes to histological grade, 18 genes to lymph node metastasis, 11 genes to residual disease, and 13 genes to the reactivity to chemotherapy. Several functionally important genes including fibronectin 1, pericentriolar material 1, beta-2-microglobulin, PPAR binding protein were identified through review of the literature.
Conclusions The cDNA microarray of ovarian cancer genes developed in this study was effective and high throughput in screening the ovarian cancer-associated genes differentially expressed. Through the studies of the cell receptor and immunity-associated genes we expect to identify the molecular biology index of ovarian cancer-associated antigens.     

芒果甙诱导鼻咽癌CNE2细胞凋亡及其对细胞内钙含量的影响

目的研究芒果甙在体外对人鼻咽癌细胞系CNE2细胞凋亡和细胞内钙离子（IECa^2＋）含量的影响。方法采用流式细胞术检测不同浓度芒果甙作用24、48、72h后诱导CNE2细胞凋亡和IECa^2＋含量的影响。结果（1）芒果甙作用24、48、72h后,不同浓度的芒果甙均可诱导CNE2细胞凋亡,随着芒果甙浓度的升高和作用时间的延长而增高;（2）不同浓度芒果甙作用24、48、72h后,CNE2细胞内IECa^2＋含量显著上升,且随着芒果甙浓度的升高和作用时间的延长而增高。结论芒果甙能显著诱导CNE2细胞凋亡;CNE2细胞内IECa^2＋含量的升高在芒果甙诱导CNE2细胞凋亡中起到重要作用。     

血卟啉衍生物光动力学疗法体外杀伤人喉癌细胞株Hep-2的实验研究

目的 探讨使用血卟啉衍生物对喉癌细胞进行光动力学治疗的有效照光时间和有效药物使用量.方法 使用波长630 nm的激光照射同血卟啉衍生物共同培养的喉癌Hep-2细胞株,使用MTT法评价不同的用药浓度(0、5、10、50、100和200μg/mL)和不同的光照能量密度(10、20、30、40和50J/cm2)细胞毒的作用.结果 随着药物浓度的增加细胞的死亡率增加,但是在100μg/mL以上增加不明显.随着光密度的增加细胞的死亡率增加,在40 J/cm2以后死亡率没有明显的增加.结论 血卟啉衍生物在630 nm的激光照射下能够有效地在体外杀伤肿瘤细胞,其杀伤的最佳效果与用药浓度和照射能量有关.     

草木犀正丁醇提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响

目的 研究草木犀正丁醇提取物在体外的抗炎作用.方法 通过LPS干预RAW264.7细胞系建立炎症细胞模型,使用1、5和10 mg/L 3种浓度的草木犀正丁醇提取物对其进行干预.ELISA法检测药物干预前后上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量,Griess反应测定NO水平;实时荧光定量RT-PCR检测TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表达;Western blot法检测COX-2的蛋白表达水平. 结果 草木犀正丁醇提取物干预后,上清中TNF-α、IL-1 β、IL-6和NO含量与模型组相比均显著降低(P<0.01),并存在剂量依赖关系;干预后细胞TNF-α,iNOS和COX-2的mRNA表达水平显著降低(P<0.01),也存在剂量依赖关系;草木犀正丁醇提取物及DM干预后COX-2蛋白水平明显降低(P<0.01).结论 草木犀正丁醇提取物可以下调TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和COX-2等炎症介质的表达,该药物体外抗炎作用可能通过抑制这些炎症介质而产生.     

鱼藤素阻断HL-60细胞生存信号通路调控作用的初步研究

目的：研究鱼藤素对人类白血病细胞株HL-60细胞系体外抗肿瘤作用,探讨AKT的功能活化状态p-AKT及抗凋亡蛋白Survivin、Bcl-2在白血病HL-60细胞中的表达及相关性。方法：采用WST-1细胞增殖实验观察细胞的生长抑制作用,原位末端标记（TUNEL）法观察细胞凋亡指数,应用AnnexinV／PI双染和流式细胞仪计数,观察细胞是否发生凋亡,利用透射电镜观察细胞形态学变化。Western blot检测鱼藤素对HL-60细胞内p-AKT、Survivin、Bcl-2蛋白表达的影响,并进行分析。结果：WST1实验结果显示,经过10～80nmol／L鱼藤素处理48h后,HL-60细胞的生长受到不同程度的抑制,抑制率分别为（10．13±3．16）％、（13．84±2．02）％、（30．72±3．82）％和（47．05±1．36）％,并呈现出比较明显的浓度依赖关系。鱼藤素诱导HL-60细胞发生了早期凋亡,40nmol／L鱼藤素处理HL-60细胞48h和72h,AnnexinV-PI^-标记的早期凋亡细胞所占的比例分别为相应对照组的2．06倍和5．33倍,透射电镜、荧光显微镜下能观察到胞核浓缩、碎裂以及凋亡小体的形成。细胞内P—AKT、Bcl-2及Survivin均发生不同程度的降解,细胞内重要的生存信号通道P13K／AKT被阻断,细胞发生凋亡。结论：鱼藤素可以通过清除细胞内重要信号蛋白、阻断细胞生存信号通路来诱导HL-60细胞发生凋亡。     

肿节风浸膏溶液对鼻咽癌细胞系CNE-2的放射增敏作用

目的：探讨肿节风浸膏对鼻咽癌细胞系CNE-2的细胞毒性作用以及对放射敏感性的影响。方法：应用克隆形成方法,观察不同浓度的肿节风浸膏对CNE-2的细胞杀灭效应,求得IC50,选择合适浓度的肿节风浸膏配合照射和单纯照射对细胞的杀伤作用,计算细胞存活率,用多靶单击数学模型进行曲线拟合作图。结果：与照射配合的肿节风浸膏的合适浓度为10mg／L。单纯照射组D0值为3．096Gy,照射加肿节风浸膏组D0值为2．441Gy,放射增敏比（SER）为1．268（3．096／2．441）。结论：肿节风浸膏具有一定的放射增敏作用。