增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

重组质粒导入真核细胞的两种方法比较

目的：比较糖化多聚赖氨酸介导和电穿孔两种方法将重组质粒导入真核细胞的优缺点。方法：用最佳电压、电容、温度、DNA浓度进行电穿孔转染,或者先使重组质粒与糖化多聚赖氨酸电性结合后,再与2.2.15细胞共同温育的方法,分别将pcEP4-aC重组质粒导入2.2.15细胞,经潮霉素筛选,比较两种方法的优劣。结果：两种方法都能成功地将重组质粒导入2.2.15细胞,但糖化多聚赖氨酸介导者,细胞生存时间较长。结论：糖化多聚赖氨酸导向配体具有良好的导入重组质粒进入肝细胞的功能,且更适合于应用。     

正、反义β-1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的转染与鉴定

目的：构建β-1，4-半乳糖基转移酶-V(β-1，4-GalTV)正、反义表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中，为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的生物学意义提供研究基础。方法：构建β-1，4-GalTV表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中；用Western印迹和Northern印迹鉴定转染情况。结果：通过酶切鉴定和测序分析，实验成功构建β-1，4-GalTV表达质粒。将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中，经鉴定表明，转染的正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1，4-GalTV表达量，而转染反义质粒则能降低细胞中β-1，4-GalTV表达量。结论：正、反义β-1，4-GalTV表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达，对分析胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的意义如对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响提供了研究基础。     

phVEGF165原位转染缺血肌肉后hVEGF及其蛋白的表达

目的：探讨慢性下肢动脉缺血的基因治疗。方法：选用血管内皮生长因子（VEGF）作为治疗基因，通过建立实验兔慢性下肢动脉缺血模型，将构建的人VEGF165cDNA真核表达载体phVEGF165注入缺血肌肉内，采用PT-PCR和原位杂交法测定肌肉hVEGF165基因表达，采用组化和Western印迹法测定其蛋白产生的表达。结果：骨骼肌细胞外源hVEGF165基表达量于注射后1周达到高峰，持续2-3周。蛋白表达于注射后2周达到高峰，维持至注射后4周。结论：骨骼肌细胞能摄取并表达外源性hVEGF165基因，并能进一步合成分泌hVEGF165蛋白。PhVEGF165肌肉直接注射的作用时间有限、范围局限、使用安全性高。     

一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法

目的：建立一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化的方法。方法：质粒DNA加入感受态细胞，经短暂冰浴和热休克后，直接涂布预热至37℃的平板。以大肠杆菌DH5α为受体菌，研究CaCl2溶液浓度、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的培养时间等对质粒转化效率的影响。结果：以100mmol／L CaCl2溶液制备感受态细胞，冰浴转化5min，经42℃热休克作用908后直接涂平板筛选转化子，获得与常规转化方法相当的转化效率。CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响，而转化时间和转化后的振荡培养时间对转化效率的影响不明显。结论：成功地建立了一种高效、快速的感受态细胞制备及质粒转化的方法。     

强直性脊柱炎累及髋关节的X线表现

目的提高数字x线（DR）对强直性脊柱炎累及髋关节的诊断水平。方法12例强直性脊柱炎累及髋关节患者均行DR检查,对其x线表现进行分析。结果12例患者中,双侧髋关节受累8例,单侧受累4例;表现髋关节间隙变窄8例,消失2例,骨赘形成9例,髋臼或股骨头囊变2例,骨质疏松4例。结论DR．平片是诊断强直性脊柱炎累及髋关节的基本检查方法。     

骨桥蛋白在卵巢癌中的表达及其与不同临床病理特征关系的Meta分析

目的:评价有关骨桥蛋白(OPN)在卵巢癌组织中表达的情况及与卵巢癌不同临床病理特征的关系。方法:系统检索NCBI PubMed、EMBASE、维普、万方数据库中截止2013年11月符合纳入标准的国内外公开发表的有关OPN在卵巢癌组织中表达的文献7篇,通过固定效应模型综合分析合并效应量,采用RevMan 5.1统计软件进行分析。结果:Meta分析显示,OPN在卵巢癌组和正常卵巢组表达差异有统计学意义[OR=20.24,95%CI(9.66,42.43),P<0.000 01]。OPN在卵巢癌组和良性卵巢组表达差异有统计学意义[OR=16.58,95%CI(9.60,28.64),P<0.000 01]。OPN在卵巢癌高分化组和中低分化组表达的差异有统计学意义[OR=0.16,95%CI(0.08,0.32),P<0.000 01]。OPN在卵巢癌临床Ⅰ-Ⅱ期组和临床Ⅲ-Ⅳ期组表达的差异有统计学意义[OR=0.16,95%CI(0.09,0.29),P<0.000 01]。OPN在卵巢癌淋巴结转移组和淋巴结未转移组表达的差异有统计学意义[OR=4.20,95%CI(2.24,7.88),P<0.000 01]。结论:OPN高表达与卵巢癌及其不同临床病理特征有显著相关性。但受纳入文献质量影响,还需进一步用国内外高质量的研究来证实。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

人IL-31基因克隆、表达及在皮肤炎症中的作用

目的 克隆人IL-31基因,构建原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达,研究hIL-31蛋白与皮肤炎症的关系.方法 采用RT-PCR克隆人IL-31基因,将其克隆到原核表达载体pET28a( ),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,用该目的蛋白刺激人表皮角质细胞HaCaT,RT-PCR检测趋化因子MIP-3β、TARC及TCA-3(I-309)mRNA的表达;小鼠皮内注射该目的蛋白,观察局部炎症表现,皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征,采血进行白细胞计数及分类,ELISA法检测血清IL-1βIL-6和TNF-α水平,流式细胞仪分析胸腺及脾脏T细胞亚群.结果 成功获得495bp的人IL-31基因,原核表达质粒构建正确,IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达;该目的蛋白可刺激HaCaT表达趋化因子MIP-3β、TARC、I-309;小鼠皮肤注射部位有脱毛,HE染色可见炎性细胞浸润,外周血白细胞总数增加,中性粒细胞比例增高,血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高,脾脏CD4 T细胞百分比增高,CD8 T细胞百分比减少.结论 人IL-31基因克隆及原核表达已获成功,hIL-31蛋白可刺激HaCaT细胞表达MIP-3β、TARC、I-309,诱导小鼠皮肤炎症反应.     

含LacZ报告基因的PcDNA3.0裸质粒转染青光眼滤过术后家兔模型的表达

目的:观察含LacZ报告基因的裸pcDNA 3.0重组质粒在体转染小梁切除术后家兔眼的表达情况,建立动物模型,评价其应用价值,为利用裸质粒对抗青光眼术后瘢痕行基因治疗打下基础.方法:制作家兔双眼小梁切除术后模型,采用自身对照,术后1d在右眼术区局部注射含LacZ报告基因的pcD-NA30裸质粒0.1mL(100μg),左眼术区注射等剂量空质粒,通过X-gal染液原位染色检测注射后1,3,6,15d组织标本中报告基因LacZ的表达情况,绘制感染效率曲线.结果:重组pcDNA 3.0裸质粒100μg可以转染术后滤过区结膜下成纤维细胞并表达携带的基因,表达高峰期3～6 d,15d时仍可检测到少量表达细胞,对照侧各个时相点均未检测到表达.结论:重组pcDNA 3.0裸质粒可以携带外源性基因转染家兔小梁切除术后术区成纤维细胞,适用于对青光眼滤过术后动物模型行基因治疗.