IL-12锚定修饰exosome的肾癌疫苗的制备及鉴定

目的制备IL-12锚定修饰exosomes(EXOs)的肾癌疫苗及其蛋白组成和功能鉴定。方法将糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)信号肽序列与白介素12基因融合构建真核双表达质粒pBIG。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测融合蛋白(CPI-IL-12)在肾癌细胞的表达。用超滤和蔗糖重水密度梯度离心法制备EXOs,透射电镜鉴定其形态,Westernblot鉴定其标志性分子热休克蛋白70(HSP70)和细胞间粘附分子(ICAM-1)及肾癌特异性抗原G250和GPI-IL-12的表达。ELISA测定EXOs负载IL-12的量,IFN-γ释放试验检测IL-12修饰的EXOs(EXO/IL-12)的功能。结果真核双表达质粒pBIG构建成功,酶切鉴定及测序正确。稳定转染后,GPI-IL-12在肾癌细胞膜高表达。分离纯化的EXOs为类圆碟形、双层膜结构,直径30～80 nm,表达HSP70、ICAM-1、G250和GPI-IL-12。ELISA测定10μg/ml的EXOs含约(80±9.6)pg/ml的IL-12,并能显著诱导T淋巴细胞产生IFN-γ。结论pBIG质粒稳定转染肾...     

奥沙利铂联合Exosome诱导的效应性T细胞抑制HepG2细胞增殖的研究

目的观察奥沙利铂(OXA)联合负载HepG2细胞裂解物的Exosome诱导的效应性T细胞对肝癌HepG2细胞系增殖的抑制作用。方法自健康人外周血中提取单个核细胞和T淋巴细胞,并以GM-CSF+IL-4的培养方案获得树突状细胞(DC)。将反复冻融后产生的HepG2细胞裂解物体外致敏DC,收集培养上清后以超高速离心法分离得到Exosome,电镜下观察其形态特征。用致敏DC及其分泌的Exosome刺激T淋巴细胞的增殖和活化。以ELISA试验检测不同刺激环境下T细胞分泌IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的能力。以细胞杀伤实验(MTT法)检测不同因素刺激后的T细胞、OXA(2.5、5.0、10.0mg.L-1)以及两者联合应用对HepG2细胞生长的抑制效应。结果与未致敏DC及其分泌的Exosome相比,HepG2细胞冻融裂解物致敏的DC及其分泌的Exosome能显著促进T细胞的增殖,并使其活化和分泌大量的IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ和TFN-α等Th1型细胞因子。活化后的T细胞、OXA以及两者联合应用对HepG2细胞体外增殖均有抑制作用,而活化T细胞联合10mg.L-1OXA对HepG2细胞的杀伤率最高,但与联合5 mg.L-1OXA的效应相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论负载肿瘤细胞抗原的DC所分泌的Exosome可在体外刺激T细胞,使其活化为具有抗肿瘤效应的细胞毒性T细胞,该细胞联合低浓度OXA能显著抑制肝癌细胞的体外增殖,并降低OXA的用量。     

外泌体miRNA在肺癌诊疗中的研究进展

外泌体是一种几乎所有细胞都能分泌的胞外小泡,在细胞和器官之间运输脂质、蛋白质和核酸。作为一种天然细胞间通信器,外泌体广泛分布在生物体液中。外泌体中的微小RNA(miRNA)在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中起至关重要的作用,并具有成为肿瘤生物标志物的潜力。本文综述了外泌体中miRNA在肺癌诊断、预后评估及药物疗效预测中的作用,并总结其面临的挑战。     

血浆外泌体中的CD48蛋白作为潜在的肝细胞癌诊断标志物的研究

背景与目的：约60%的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者在晚期才被确诊,因而无法得到及时有效的治疗,目前临床上常用于HCC诊断的血清标志物的灵敏度均偏低。本研究通过分析血浆外泌体蛋白质组的表达差异,鉴定可能用于HCC诊断的候选外泌体蛋白质标志物。方法：首先,采用鸟枪法蛋白质组质谱分析方法,对发掘人群[包括4名健康对照者（healthy control,HC）组和4例HCC患者组]的血浆外泌体进行全蛋白质组的定性和定量分析,并筛选差异表达蛋白质。然后,采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）在独立的验证人群[包括56例HCC患者组、20例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者组和48名HC组]中进行验证实验,并评估候选蛋白质分子在HCC诊断中的潜在价值。结果：在发掘人群中,共鉴定到1 434种血浆外泌体蛋白质,其中的CD48蛋白在HCC患者中的表达水平显著高于HC组个体。进一步采用ELISA在独立验证人群中证实CD48蛋白在HCC患者中的表达水平显著高于LC和HC个体,受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线的曲线下面积（area under curve,AUC）为0.886。当联合检测血浆外泌体中的CD48蛋白和血浆中的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）时,AUC可提升至0.970。结论：血浆外泌体中的CD48蛋白可能作为HCC的候选诊断标志物,当其与AFP联合应用时可能进一步提高HCC的临床诊断能力。     

精液外泌体在生殖系统中的研究进展

除了运输精子与卵子受精外,精浆(seminal plasma,SP)在生育过程中具有调节母胎免疫耐受、促进精卵结合、调控着床前胚胎发育及表观遗传等重要作用。外泌体(exosomes,Exos)为最新发现的细胞间通讯形式,可通过与靶细胞融合或传递其内载物参与许多生命活动。精液外泌体(seminal exosomes,SE)大量存在于SP中。研究表明,SE可广泛参与男性及女性生殖活动的调控,如精子完整性、精子获能、精子活力及母胎免疫等。因此,本文对SE在生殖系统中的研究做一综述,以期为男性不育、女性不孕的诊疗及辅助生殖技术的完善提供相应的理论依据。     

树突状细胞来源的exosomes研究进展

Exosomes是多种活细胞晚期内体分泌的小囊泡体,不同来源的exosolnes其特异性功能与它所含的特异性蛋白质以及它所处的做环境密切相关。树突状细胞来源的exosomes（Dex）富含树突状细胞的MHC—I／II类分子、协同刺激分子等多种生物活性分子,在体内、外实验中显示出与树突状细胞相似的功能．可诱发机体免疫应答或诱导免疫耐受：作为一种新型的非细胞疫苗,exosomes在抗肿瘤免疫治疗以及抑制移柑{免疫排斥和自身免疫性疾病治疗等各方面的应用前景受到极大的关注。     

Application of engineered exosomes in bone repair and regeneration北大核心

BACKGROUND: Bone defect caused by disease or accident is very common in clinic. The current main treatment method for bone defect repair is autologous bone grafting. Autologous bone grafting may cause complications, such as secondary infections and scars. The other treatments, such as allogeneic bone transplantation, may have risks of immune rejection and disease transmission. Furthermore, safety considerations and the performance of biomaterials and cell-based treatment require further clarification. In recent years, engineered exosomes have shown good application potential in bone repair and bone regeneration, and have become a current research hotspot. OBJECTIVE: To review the research progress of engineering exosomes in promoting bone defect repair and bone regeneration. METHODS: The PubMed, CNKI and Wanfang databases were searched for relevant articles with the key words of “exosome; engineered exosomes; bone repair; bone regeneration” in English and Chinese, respectively. The search time was from January 1980 to September 2020. Articles that were not related to the purpose of the research and repetitive articles were excluded, and 56 articles that met the criteria were finally included for review. RESULTS AND CONCLUSION: The engineered exosomes can not only promote bone differentiation of osteoblast-related cells and new blood vessel formation, but also target tissues and cells. A large number of experiments have proven that the engineered exosomes for repairing bone defect and promoting bone regeneration is a feasible strategy. © 2022, Publishing House of Chinese Journal of Tissue Engineering Research. All rights reserved.     

miR-22修饰的骨髓间充质干细胞外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡

目的探讨miR-22修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法扩增培养从SD大鼠骨髓中分离的BMSCs,将携带miR-22重组慢病毒载体及其阴性对照(miR-NC)载体分别转染至BMSCs,并提取转染后BMSCs的外泌体。将60只SD大鼠随机分为Sham组、AMI组、Exo BMSCs组、Exo BMSCs/miR-NC组和Exo BMSCs/miR-22组,每组12只。采用冠状动脉左前降支结扎术构建AMI大鼠模型,于心肌梗死区原位注射外泌体进行干预。干预72 h后,采用超声心动图监测大鼠心脏功能;TTC染色观察大鼠心肌梗死情况;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡水平;qRT-PCR检测心肌组织中miR-22及p53 mRNA表达水平;Western blot检测心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶剪切体(Cleaved-caspase-3)及p53蛋白表达水平。结果与Sham组比较,AMI组大鼠心脏功能明显降低(P <0.05),心肌梗死面积(%:1.16±0.84 vs.38.68±5.31)和心肌细胞凋亡率(%:9.04±1.95 vs.66.70±5.92)明显增加(P <0.05),心肌组织中miR-22和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P <0.05),而p53、Bax和Cleavedcaspase-3等蛋白表达水平明显升高(P <0.05);与AMI组比较,各外泌体干预组大鼠心功能明显改善(P <0.05),心肌梗死面积(%:38.68±5.31 vs.23.54±3.94,22.33±4.12,13.79±2.25)和心肌细胞凋亡率(66.70±5.92 vs.43.73±3.39,42.67±2.87,30.73±2.97)明显降低(P <0.05),心肌组织中miR-22以及Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P <0.05),而p53、Bax和Cleaved-caspase-3等蛋白表达水平明显降低(P <0.05),其中Exo BMSCs/miR-22组大鼠各指标改善情况均优于Exo BMSCs组和Exo BMSCs/miR-NC组。结论 miR-22修饰的BMSCs外泌体可有效抑制p53介导的心肌细胞凋亡,从而改善AMI大鼠的心功能。     

血浆外泌体miR-212、miR-132与颅脑损伤严重程度和Rotterdam CT评分的关系

目的 探讨血浆外泌体miR-212、miR-132水平与颅脑损伤（TBI）严重程度和Rotterdam CT评分的关系。方法 前瞻性收集2019年3月~2020年10月收治的TBI共76例,另选择我院体检的健康成年人38例为对照。提取血浆外泌体并采用实时荧光定量PCR法检测miR-212、miR-132表达水平。结果 76例TBI中,轻型19例,中型35例,重型22例。TBI血浆外泌体miR-212、miR-132水平均明显低于对照组（P<0.05）。与轻型TBI比较,中、重型TBI组血浆外泌体miR-132水平明显降低（P<0.05）;与中型TBI比较,重型TBI血浆外泌体miR-212、miR-132水平明显降低（P<0.05）。血浆外泌体miR-212（（r=0.396）、miR-132（r=0.716）水平与入院GCS评分呈明显正相关（P<0.001）。血浆外泌体miR-212水平（r=-0.375）和miR-132水平（r=-0.613）与入院Rotterdam CT评分呈明显负相关（P<0.05）。结论 TBI病人血浆外泌体miR-132、miR-212水平明显下降,并且随着TBI损伤程度加重和入院Rotterdam CT评分增加而明显降低。这提示血浆miR-132、miR-212可能是TBI潜在的生物标记物。