PCNA在大鼠肾上腺细胞培养中的表达及其意义

目的:探讨增殖细胞核抗原(PCNA)在大鼠肾上腺细胞培养过程中的表达及其意义。方法:应用SP免疫组化法,检测PCNA在大鼠肾上腺细胞培养不同时期表达的强度变化,同时测定肾上腺细胞分泌皮质酮功能的动态变化。结果:在肾上腺细胞体外培养过程中,第3、5、7天,PCNA蛋白表达逐渐增强,分别为(18±3)%、(38±5)%、(70±6)%,第9、11天与第7天相比,PCNA蛋白表达减弱(P<0.05),皮质酮浓度测定显示在第7天皮质酮浓度达到最高峰(101.2±15.8nmol/L),随后逐渐下降,与PCNA蛋白表达强度的变化趋势一致。结论:肾上腺细胞体外培养在第7天肾上腺细胞增殖最旺盛,而且肾上腺分泌皮质酮达到最高峰。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

大肠癌裸鼠移植瘤实验模型的建立及T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1封闭载体的治疗作用

目的 通过建立大肠癌SW620细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1( Tiam1)封闭载体在动物体内的治疗作用.方法 构建编码一条短发夹RNA的Tiam1质粒表达封闭载体,并用之转染SW620细胞;应用Hoechst 33342荧光染色技术观察细胞形态学变化.将皮下接种SW620细胞的裸鼠分为3组,每组8只,在接种后第2周分别瘤内注射生理盐水(对照组)、HK错配链(HK组)和Tiam1封闭载体(Tiam1组).第16天处死各组裸鼠,取出移植瘤移重.结果 通过DNA测序证实封闭载体构建成功.SW620细胞经Tiam1封闭载体转染后,细胞核可见凋亡小体.对照组平均移植瘤重量(2.84±0.27)g,HK组(2.89±0.18)g,Tiam1组(1.47±0.20)g,Tiam1组与其他2组比较差异有统计学意义(P＜0.01),而HK组和对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 所构建的Tiam1封闭载体能有效抑制大肠癌裸鼠皮下移植瘤生长.     

狗骨髓基质细胞的分离培养及成骨潜能的研究

目的观察狗骨髓基质细胞(MSCs)的生长特点及诱导条件下的成骨能力,为利用狗的MSCs进行成骨研究提供实验基础。方法从成年狗胫骨取骨髓进行MSCs培养,检测细胞周期;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖;测定碱性磷酸酶活性;用Von Kossa染色法观察钙化结节。观察在条件培养液中MSCs生长及成骨分化情况。结果MSCs增殖能力强,细胞周期显示有20%的细胞处于G0/G1期。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性明显增高,10~12 d达到高峰,并出现钙化结节。结论体外培养狗的MSCs具有分化成骨的潜能,增殖能力强,可作为骨组织工程的种子细胞。     

苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

目的观察苦参碱对免疫低下小鼠免疫功能的影响,寻找苦参碱治疗慢性乙型肝炎的可能机制。方法采用环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,小鼠腹腔注射苦参碱后,观察苦参碱对小鼠网状内皮系统吞噬廓清能力、对T淋巴细胞酯酶染色率、对二硝基氯苯所致迟发型超敏反应的影响、和对小鼠血清溶血素抗体的影响。结果苦参碱能抑制T淋巴细胞酯酶染色率,增强网状内皮系统的吞噬能力,但对迟发型超敏反应和血清溶血素抗体无明显影响。结论苦参碱对免疫低下小鼠的细胞免疫具有明显抑制作用,并增强其非特异性免疫。     

Fluid Shear Stress Stimulates Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament Cells via the Extracellular Signal‐Regulated Kinase 1/2 and p38 Mitogen‐Activated Protein Kinase Signaling Pathways

Background: Fluid shear stress (FSS) is a major type of mechanical stress that is loaded on human periodontal ligament cells (hPDLCs) during mastication and orthodontic tooth movement. This study aims to clarify the effect of FSS on the osteogenic differentiation of hPDLCs and to further verify the involvement of mitogen‐activated protein kinase (MAPK) signaling in this process. Methods: After isolation and characterization, hPDLCs were subjected to 2‐hour FSS at 12 dynes/cm², and cell viability, osteogenic gene mRNA expression, alkaline phosphatase (ALP) activity, secretion of Type I collagen (COL‐I), and calcium deposition were assayed. The levels of phosphorylated p38 and phosphorylated extracellular signal‐regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in response to FSS were detected by Western blot, and the involvement of ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathways in hPDLC osteogenesis under FSS was investigated using the specific MAPK inhibitors U0126 (2Z,3Z)‐2,3‐bis[amino(2‐aminophenylthio)methylene]succinonitrile,ethanol) and SB203580 (4‐[4‐(4‐fluorophenyl)‐2‐(4‐[methylsulfinyl]phenyl)‐1H‐imidazol‐5‐yl]pyridine). Results: The application of FSS on hPDLCs induced an early morphologic change and rearrangement of filamentous actin. ALP activity, messenger RNA (mRNA) levels of osteogenic genes, COL‐I, and osteoid nodules were significantly increased by FSS. Moreover, ERK1/2 and p38 were activated in different ways after FSS exposure. U0126 and SB203580 completely blocked the FSS‐induced increases in ALP activity and osteogenic gene mRNA expression and osteoid nodules formation. Conclusions: FSS is an effective approach for stimulating osteogenic differentiation of hPDLCs. The ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathways are involved in this cellular process.     

阿霉素诱导鸟嘌呤-四联体形成对Tca8113细胞端粒酶及细胞周期的影响

目的：探讨阿霉素影响端粒酶活性、端粒酶mRNA表达、细胞周期及周期蛋白表达的分子作用机制。方法：采用端粒重复序列扩增法（TRAP）、改良TRAP—G4法和RT—PCR法检测Tca8113细胞端粒酶活性变化、端粒酶hTERT和TP1mRNA水平；流式细胞仪分析细胞周期；采用Western印迹法测定CyclinB1和CyclinA表达水平。采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：所有实验浓度阿霉素均可降低Tca8113细胞端粒酶活性．当端粒酶作用底物变为5＇-（GGGATr），GGGTT-3’时，端粒延伸反应完全受到抑制；5μg/ml阿霉素作用24h后，hTERT和TP1mRNA表达降低，CyclinB1表达明显增强，G2／M期细胞百分率显著下降。结论：阿霉素抑制端粒酶活性、降低端粒酶表达、影响细胞周期及CyclinB1表达的作用机制与其诱导鸟嘌呤-四联体形成有关。     

鼠颊黏膜干细胞的分离及鉴定

目的 探讨鼠颊黏膜干细胞的体外分离和培养方法,以获得稳定生长的黏膜干细胞.方法 DispaseⅡ酶和Trypsin-EDTA两步法分离昆明小鼠颊黏膜上皮细胞,接种于以小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞为滋养层的培养板中.达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)培养24 h后换用角质细胞无血清培养基(keratinocyte serum-free medium,K-SFM)继续培养,部分细胞72 h后行成骨、成脂诱导和改良型Kaplow碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色鉴定;部分细胞继续培养5 d后,消化转移至Ⅳ型胶原预包被的培养板中,加入黏膜干细胞培养基培养,观察细胞克隆形成和成骨、成脂诱导、兔抗鼠角蛋白和ALP染色结果.结果 初次分离的上皮细胞群83.96%处于G0或G1期,培养72 h后可见克隆样生长细胞,成骨、成脂诱导和ALP染色均呈阳性;细胞在Ⅳ型胶原包被的培养板上快速贴壁,呈圆形或卵圆形,胞体小,折光性强,克隆样生长,兔抗鼠角蛋白、ALP染色和成骨、成脂诱导均呈阳性.结论 运用滋养层细胞培养法获得大量干细胞样上皮细胞后,Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM与NIH3T3培养上清液混合培养法可实现鼠颊黏膜干细胞的初步纯化和快速培养.     

口腔鳞状细胞癌中p27与Skp2蛋白表达及其意义的初步观察

目的:探讨p27与Skp2蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其与口腔鳞状细胞癌临床病理之间的相互关系。方法:免疫组化SP法检测p27、Skp2蛋白在69例口腔鳞状细胞癌和12例正常口腔黏膜组织中的表达情况,并分析其与患者的年龄、性别、肿瘤的部位、临床分期、病理分级、颈淋巴结转移之间的相关性。结果:口腔鳞状细胞癌中p27蛋白的阳性率63.73%明显低于正常黏膜组织92.72%(P<0.05),Skp2蛋白在口腔鳞状细胞癌中的阳性率19.02%明显高于正常黏膜组织4.24%(P<0.05)。p27蛋白阳性表达率与肿瘤的临床分期、病理分级、颈淋巴结转移呈负相关(P<0.05),Skp2蛋白阳性表达率则与以上临床病理特征呈正相关(P<0.05);二者的阳性表达率与口腔鳞状细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤部位无关(P>0.05)。p27蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达与Skp2蛋白呈负相关(P<0.05)。结论:Skp2蛋白表达与靶蛋白细胞周期抑制因子p27降解相关,可能参与了口腔鳞状细胞癌的发生、发展。联合检测p27和Skp2蛋白表达有助于判断口腔鳞状细胞癌的恶性程度和预后。     

组织工程牙周膜细胞片的体内实验研究

目的:探索一种形成组织工程牙周膜的新方法并建立动物模型,为牙周组织工程奠定基础。方法:原代分离培养人牙周膜细胞,部分细胞复合明胶海绵设为对照组;另一部分细胞经特殊条件连续培养成细胞膜片设为实验组。2组实验结果择优复合支架材料后植入裸鼠皮下,4周后取材行组织病理检测。结果:经特殊条件连续培养的牙周膜细胞层叠交错相连形成具有良好的机械加工性能的生物膜片,该膜片经裸鼠体内培养形成牙周膜样组织,并在近羟基磷灰石支架侧有矿化的牙骨质样结构生成。结论:该方法制备的牙周膜细胞片在牙周组织工程具有良好的应用前景。