丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

胆道梗阻肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化

目的动态观察在胆道梗阻和梗阻缓解过程中,肝细胞膜Na+/K+ATP酶活性变化的规律。方法对130只胆道梗阻大鼠模型的260份样本进行组织化学染色,结合免疫电镜方法,在肝细胞膜上染色定位Na+/K+ATP酶,计算机图像分析测定,半定量比较肝细胞膜Na+/K+ATP酶活性。结果Na+/K+ATP酶广泛存在于肝细胞膜上,但其活性(相对灰度比值)在肝细胞血窦面、肝细胞间面和肝细胞毛细胆管面呈不均匀分布,分别为107.60±16.64、74.40±9.37、90.30±8.04。反映了肝细胞分泌胆汁的正常极性。Na+/K+ATP酶活性在胆道梗阻和梗阻缓解过程中随着胆红素水平的升高或降低而发生变化,并且随着梗阻和缓解的时间延长而明显下降或改善。在梗阻14d时,分别降为84±10、60±7、65±15;在梗阻14 d缓解1 d时,Na+/K+ATP酶活性分别为86±14、62±6、68±19,而在缓解7 d时其活性分别恢复为96±8、65±6、85±7。结论胆道梗阻对肝细胞膜Na+/K+ATP酶活性的影响可能与胆道梗阻时肝细胞代谢胆红素障碍有关。     

不同预处理中线粒体KATP通道开放对未成熟心肌的作用

目的　了解线粒体ATP敏感性钾通道 (mKATP)开放在不同预处理过程中对幼兔心脏的影响 ,并探讨其机制。方法　幼兔 (小于 2 8d) 34只随机分成 5组 ,对照组 (n =8) :平衡 30min后缺血再灌注 ;二氮嗪预处理组 (n =8) :缺血前二氮嗪 ( 10 0 μmol/L)灌注 5min后重碳酸盐缓冲液 (KH液 )冲洗 10min ,St.ThomasⅡ (STH)停跳 ;二氮嗪 + 5 羟葵酸 ( 5 HD)预处理组 (n =5 ) :二氮嗪 ( 10 0 μmol/L)和 5 HD( 10 0 μmol/L)一起灌注 5min ;缺血预处理 (IPC)组 ( n =8) :平衡 15min后全心缺血 5min ,复灌 10min行IPC ,STH停跳 ;IPC + 5 HD组 (n =5 ) :IPC前用 5 HD ( 10 0μmol/L)灌注 5min。采用LangendOrff模型 ,常温 ( 38℃ )缺血 30min ,复灌 45min。 结果　缺血 /再灌注 (I/R)后二氮嗪组的线粒体评分较IPC组 (P <0 .0 5 )和对照组 (P <0 .0 1)低 ,IPC前给予 5 HD后线粒体评分仍较对照组低 (P <0 .0 5 )。二氮嗪组和IPC组左室发展压力 (LVDP)、左室压力上升和下降最大速率 (±dp/dtmax)恢复在多个时间点上均优于对照组 ,心肌组织ATP含量高于对照组 (P <0 .0 1) ,心肌酶较对照组降低 (P <0 .0 1)。结论　二氮嗪预处理能产生与IPC相似的心肌保护作用 ,并且对线粒体的保护效果较IPC好。mKATP通道和细胞膜KATP     

体外药敏试验ATP-TCA与流式细胞仪在肝癌化疗中的应用

目的 探讨体外化疗药敏试验系统（ATP-TCA系统）联合流式细胞仪（FCM）在肝癌化疗中的应用及其结果之间的关系。方法 取24例肝癌切除，活检或穿刺组织行体外药敏试验和流式细胞仪P170检测，并分析二者间的关系。结果 ATP-TCA的可评估率为91.67%;10种化疗药物的敏感率分别为：氟尿嘧啶5.00%，诺消灵5.00%，顺铂14.26%，足叶乙甙19.05%，草酸铂19.05%,丝裂霉素23.81%，表阿霉素28.57%，开普拓45.46%，健择47.62%，泰素63.64%；P170检测阳性率为57.14%；丝裂霉素，表阿霉素的敏感率在P170阴性表达时高，开普拓健择，泰素的敏感率高且在P170阳性表达和阴性表达时无显著差异。结论 ATP-TCA法联合FCM可较好用于肝癌化疗药物的筛选；丝裂霉素，表阿霉素可用于P170阴性表达的病人，开普拓，健择，泰素可用于P170阳性表达的病人。     

银杏叶提取物EGb 761对失神经骨骼肌Na+-K+-ATP酶活性的影响

目的观察银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGb 761)对失神经肌肉Na+-K+-ATP酶活性的影响.方法选用SD大鼠16只,按术后注射药物的不同随机分为银杏叶提取物组(实验组)和生理盐水组(对照组).显露左侧坐骨神经,切断并切除0.5 cm神经段.分别将神经远、近端反折后结扎.术后两组分别经腹腔注射EGb 761(100 mg/kg-1*d-1)和同体积的生理盐水.术后6周取左侧小腿三头肌,测定其Na+-K+-ATP酶活性.结果实验组失神经肌肉Na+-K+-ATP酶的活性优于对照组,两者差异有显著性意义(t= 2.51,P < 0.05).结论银杏叶提取物能改善大鼠失神经骨骼肌Na+-K+-ATP酶的活性,表明其对失神经肌萎缩有一定的保护作用.     

中性粒细胞与急性肺损伤

在急性肺损伤（ALI）及ARDS的发生，中性粒细胞（PMN）过度活化起着重要作用。其机制涉及PMN与肺血管内皮细胞间的粘附反应、PMN的效应反应，如呼吸爆发、脱颗粒、释放炎性细胞因子、凋亡抑制、脂质介质释放等多个方面。     

应用ATP荧光法监测腔镜器械人工清洗与机械清洗效果的随机对照研究

目的:应用ATP生物荧光法监测和评价腔镜器械人工清洗与机械清洗质量的效果.方法:随机抽取2009年7、8月份进行腹腔镜胆囊切除和卵巢手术所使用的腔镜器械,用简单随机抽样法(抽签法)随机抽取30套腔镜器械,包括:分离钳及管腔、5mm穿刺器各30件.按国家卫生部<内镜清洗消毒技术操作规范(2004年版)>要求进行人工清洗与机械清洗.在清洗前、初步冲洗后、酶液浸泡刷洗后、超声清洗后、干燥后等5个时间点,分别采用ATP生物荧光测试管中专用棉拭子沾湿无菌水进行取样,测定相对光单位值(RLU).RLU值≤2000为清洗合格判断标准.结果:清洗前不同腔镜部件的RLU值存在统计学差异(X2=11.265,P=0.000),其中操作钳齿RLU值最高.完成清洗干燥程序后与清洗前比较,3种不同腔镜部件的RLU值均减少,存在统计学差异(P＜0.05).机械清洗组的操作钳齿和钳柄管腔,其RLU值均低于人工清洗组(P＜0.05),有统计学差异;而穿刺器在两组清洗方法中RLU值无统计学差异(P＜0.05).清洗后,90个内镜部件的清洗合格率为84.4%,不合格率为15.6%(X2=69.091,P=0.000).三种不同部件的清洗合格率存在统计学差异,清洗合格率由高到低依次为钳柄管腔(93.3%)、操作钳齿(90%)、穿刺器(70%),(X2=6.948,P=0.031).通过清洗和干燥后,三种腔镜器械的清洗合格率均比清洗前提高,存在统计学差异(P＜0.05).结论:腔镜器械采用机械清洗的清洗效果优于人工清洗.     

雷帕霉素对炎性反应状态下肾小球系膜细胞内脂质稳态的影响

Objective To investigate the effect of rapamycin on cholesterol homeostasis of glomerular mesangial cells and the underlying mechanism. Methods Glomerular mesangial cell line (HMCL) cells were cultured and divided into control group, IL-1β group and different concentration rapamycin groups. Intracellular cholesterol accumulation was observed and measured by oil O staining and HPLC. Real-time quantitative PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of LDLR, PPARγ, LXRα, ABCA1 in HMCL after the treatment with IL-1β and rapamycin. Results Rapamycin had no significant influence on intracellular cholesterol concentration under normal condition. IL-1β significantly increased the intracellular cholesterol concentration by 143％ of control (P<0.05), and 10, 50, 100 ?滋g/L rapamycin could significantly inhibit the effect of IL-1β (87％, 116％, 96％ of control respectively, all P<0.05). Rapamycin could suppress the increased expression of LDLR caused by IL-1β on both mRNA and protein level in a dose-dependent manner（P<0.01）. Rapamycin dose-dependently up-regulated the reduced mRNA and protein expression of ABCA1, the decreased mRNA expression of PPARγ and LXRα induced by IL-1β as well (P<0.01）. Conclusion Rapamycin may contribute to the maintenance of intracellular cholesterol homeostasis in glomerular mesangial cells under inflammatory state by both reducing cholesterol uptake and promoting cholesterol efflux.     

组织血液灌注与微循环的病理生理(2)——氧化应激与疾病

哺乳动物的呼吸系统从大气摄人的氧气中80％～90％用于体内线粒体的能量代谢过程，在三羧酸循环中，以4次脱氢的方式为后续的氧化磷酸化提供还原当量（H^＋和e），脱下的氢3次由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD^＋）接受，1次由黄素腺苷二核苷酸（FAD^＋）接受，然后H^＋及e经呼吸链（电子传递链）和ATP合成酶进行氧化磷酸化，最后氧接受H^＋和e还原成H2O，并产生ATP。如果各种病理因素使呼吸链传递e的效能下降，氧化磷酸化过程减弱，ATP生成减少，机体正常的还原／氧化平衡状态被破坏。可造成机体的代谢、功能紊乱。     

二氮嗪预处理对肝硬化大鼠肝脏的保护作用

目的探讨采用线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP通道)选择性开放剂二氮嗪(DE)进行预处理能否模拟缺血预处理(IP)对硬化肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法雄性肝硬化SD大鼠随机分为5组(每组8只)。IP组以肝缺血5 min作预处理;DE组以静脉注射DE作为预处理;DE 5-HD组是在DE组基础上再予静注mitoKATP通道选择性阻滞剂5-hydroxydecanoate(5-HD)进行预处理;对照组(C组)以静注等量生理盐水作为预处理;上述4组均在预处理后行肝缺血45 min再灌注60 min;缺血方式均为70%肝脏热缺血。假手术组(S组)仅行开腹,不作任何其他处理。完成预定实验操作后分别取血用于血清谷丙转氨酶(ALT)与乳酸脱氢酶(LDH)检测,切取肝组织用于测定ATP酶活力、湿重/干重(W/D)的测定及观察显微、超微结构变化。结果C组ALT,LDH,ATP酶及W/D的水平明显高于S组(P<0.01),肝脏的显微及超微结构损伤明显;IP组与DE组的各项肝组织损伤指标均明显好于C组,ATP酶活性低于C组(P<0.05及P<0.01);而DE 5-HD组的肝损伤指标均差于DE组,ATP酶活性高于DE组(P<0.05及P<0.01)。结论使用DE进行药物预处理能够模拟出IP效应,对肝硬化大鼠肝脏I/R损伤具有保护作用,其作用可能与下调肝组织ATP酶活性,减少ATP大量分解,使肝组织ATP含量升高,改善肝能量代谢,增加能量储备;改善肝组织微循环,减轻肝脏水肿有关。