胃癌围手术期T细胞亚群和NK细胞活性检测的临床意义

目的 探讨胃癌围手术期细胞免疫功能的变化及与肿瘤分期的关系。方法 采用流式细胞仪测定40例胃癌患者围手术期外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞活性。结果 胃癌患者术前外周血CD_3~+细胞、CD_4~+细胞、CD_4~+/CD_8~+比值和NK细胞活性明显低于正常对照组,CD_8~+细胞显著升高,并与病理分期相关,分期越晚改变越大。手术后以上指标可显著改善。结论 胃癌患者细胞免疫功能低下,病理分期越晚细胞免疫功能越低,肿瘤负荷是其主要原因。     

骨髓间充质干细胞经蛛网膜下腔移植治疗大鼠脊髓损伤及其对T细胞亚群影响的研究

目的将异体骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）移植至脊髓损伤（spinalcord injury,SCI）大鼠蛛网膜下腔,探讨其治疗效果以及对T细胞亚群的影响。方法取6周龄SD大鼠10只,采用密度梯度离心法进行细胞分离及培养,传至第6代后收集细胞。雌性8周龄SD大鼠60只,采用重物打击法制备SCI模型,从BBB后肢功能评分为0的存活大鼠随机取40只分为两组,每组20只。实验组（A组）：经蛛网膜下腔注入经BrdU标记的细胞浓度为2×106/ml的MSCs细胞悬液1ml;对照组（B组）：注入等量L-DMEM。另取20只正常雌性8周龄SD大鼠作为空白组（C组）。于第1、2和3周行BBB后肢功能评分,并采外周血经流式细胞仪检测T细胞亚群;第3周时,A、B组大鼠取损伤处脊髓,行组织切片观察。结果A组BBB后肢功能评分第3周优于B组,但仍低于C组,差异均有统计学意义（P〈0.05）;CD4＋T细胞在第1、2和3周均较B、C组少,CD8＋T细胞在第2、3周较B、C组少,CD4＋/CD8＋T细胞比值在第1周较B、C组少,上述差异均有统计学意义（P〈0.05）;但CD4＋/CD8＋T细胞比值在第2、3周与B、C组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。组织学观察,A组第3周脊髓损伤处空泡缩小,有组织长入,较B组有轻微改善,但未明确见到BrdU阳性标记的MSCs。结论MSCs经蛛网膜下腔移植对SCI有一定治疗作用,且在一定时间内不引起机体排斥反应,在第1周对T细胞亚群的抑制更为明显,为临床利用MSCs治疗SCI及其他疾病提供了免疫学实验依据。     

不同干预因素对供皮区愈合的影响

目的试图按循证医学的原则去探讨较厚供皮区的较好覆盖方法,以提高患者的生活质量。方法①不同生物敷料覆盖供皮区的观察:采用随机区组设计方法,将8例患者16鼓皮供区分为8个区组,每组4个创面。观察区分别行"L"、"Z-S"、"Z-Y"、"Z-J"覆盖。②复合皮与凡士林油纱覆盖供皮区的对比观察:选取后躯作供皮区,取皮厚度0.6mm,共23例,将1鼓供区创面一分为二,共46处创面,形成23个对子,随机选取1组应用"F"覆盖,对照区单用"L"。③皮下注液对取皮厚度的影响:当同时切取2鼓时,1鼓注液另一鼓不注液;当切取1鼓时,其中1/2注液,另1/2不注液。皮下注液完成后,同一医师用同一皮鼓切取同厚皮肤(0.6mm)。取皮结束时供皮区均应用凡士林油纱覆盖。用活检器分别取自游离皮肤组织注液区和非注液区各一块,置体积分数10%的中性缓冲甲醛中固定。结果从愈合天数上观察不同覆盖物中以"Z-S"组愈合最快,其次是"L"组,自愈最慢的是"Z-Y"组。"Z-J"组供区愈合后外观瘢痕增生程度及患者自诉瘙痒、疼痛程度明显减轻。"F"组瘢痕增生程度及患者自诉瘙痒疼痛程度最轻,外观接近正常皮肤;取皮前皮下注液后使得皮肤线向外推移,较少或不伤及网状深层,便于取得较薄的中厚皮,从而有利于供皮区愈合。结论对于中厚或厚中厚供皮区如条件允许采用脱细胞异体真皮加自体刃厚皮所形成的复合皮移植效果最好,桀亚敷料皮加自体微粒皮或生物敷料A加自体微粒皮进行供皮区覆盖、皮下注液后取皮等方法均有助于提高供皮区愈合质量。     

改良法分离睾丸支持细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡

目的改进睾丸支持细胞（Sertoli细胞）的分离方法及培养条件,探讨Sertoli细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡的作用机制。方法取2～4周龄的SD大鼠睾丸,采用Ⅴ型胶原酶、胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶二步消化法制备Sertoli细胞。用免疫组织化学法（SABC法）检测Sertoli细胞中Fas配体（FasL）、转化生长因子p,（TGF-β1）、clusterin的表达;流式细胞仪检测Sertoli细胞诱导异种淋巴细胞凋亡情况。结果在分离培养纯化过程中,Sertoli细胞占培养细胞总数的90％以上,生长状况良好,能稳定表达FasL、TGF-β1和clusterin,并且能够诱导异种淋巴细胞发生凋亡。结论应用本实验方法能够稳定获得大量高纯度的Sertoli细胞,并且能够发挥其免疫豁免的功能,从而用于细胞联合移植。     

转染可溶性CD40基因的树突状细胞在体外对T淋巴细胞功能的抑制作用

目的探讨转染可溶性CD40(sCD40)基因的树突状细胞(DC)在体外对T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性的影响。方法采用脂质体转染法,将携带鼠CD40胞外区和绿色荧光蛋白的融合基因的质粒pEGFP-N1/sCD40转染小鼠DC细胞株(DC 2.4)。以Balb/c小鼠淋巴细胞为反应细胞,分别以转染组DC、空载体转染组(空载体组)DC和未行转染处理的DC(空白DC)作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞培养,四唑氮化合物比色法检测细胞增殖情况。用乳酸脱氢酶释放试验和流式细胞术检测转染组DC及其培养上清液对CTL细胞毒活性及其凋亡的影响。结果转染组DC及其培养上清液对同种细胞刺激的淋巴细胞增殖反应有显著的抑制作用(P<0.05),并对特异性CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用(P<0.05);转染组DC可诱导CTL凋亡(P<0.05)。结论稳定表达sCD40-EGFP融合蛋白的DC,在体外对T淋巴细胞的增殖和CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用,并可诱导CTL凋亡。     

自发免疫耐受大鼠移植肝内调节性T细胞的生物学特性

目的研究大鼠肝移植后自发免疫耐受的形成与移植肝内CD4~ CD25~ 调节性T细胞(Tr细胞)的关系。方法按供、受者不同将实验分为3组。急性排斥组:DA大鼠为供者,LEW大鼠为受者;自发耐受组:LEW大鼠为供者,DA大鼠为受者;同基因组:供、受者均为DA大鼠。各组均建立大鼠原位肝移植模型。分别在肝移植术后4、7、14、30和90 d时采用密度梯度离心法分离移植肝内淋巴细胞,免疫磁珠分离(MACS)法分选出CD4~ CD25~ Tr细胞;用流式细胞术(FCM)检测细胞纯度,同时分析CD4~ CD25~ Tr细胞比例的变化;体外细胞增殖试验研究CD4~ CD25~ Tr细胞对CD4~ CD25~-T细胞的免疫抑制作用。结果肝移植早期,急性排斥组和自发耐受组移植肝内CD4~ CD25~ Tr细胞比例均明显增加,其中急性排斥组增加更为明显;移植后4 d左右,两组CD4~ CD25~ Tr细胞比例开始下降,急性排斥组的下降幅度较大;移植后30 d,自发耐受组受者的移植肝内CD4~ CD25~ Tr细胞比例达到第2次高峰,约在移植后90 d时下降至正常生理水平。移植后7 d左右,急性排斥组受者均因发生排斥反应而死亡,而自发耐受组受者均存活。此外,CD4~ CD25~ Tr细胞能有效抑制CD4~ CD25~-T细胞的增殖。结论CD4~ CD25~ Tr细胞是一种具有特异免疫调节功能的T细胞亚群,其主动的免疫抑制功能可能是诱导大鼠肝移植自发免疫耐受的机制之一。     

γ干扰素体外诱导骨髓间充质干细胞的IDO表达及其免疫调节作用

目的探讨γ干扰素(IFN-γ)体外诱导作用成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)的表达及IDO对异基因T淋巴细胞增殖的影响。方法从人骨髓中分离、培养MSCs,观察传代3次以上的细胞形态,应用流式细胞术检测其表面标志,以鉴定其纯度。分别用浓度为0、20、50、100、200 U/ml的IFN-γ诱导作用MSCs后,以逆转录聚合酶链反应检测IDO mRNA的表达,蛋白印迹法检测IDO蛋白的表达,反相高效液相色谱法检测色氨酸的特异代谢产物犬尿氨酸的特异代谢率,以此判断IDO的活性。以丝裂霉素C灭活的外周血单个核细胞为刺激细胞,异基因T淋巴细胞为反应细胞,与经200 U/ml IFN-γ作用的MSCs组成混合淋巴细胞培养体系,MSCs与反应细胞的比例分别为1:5、1:10、1:50及1:100,部分混合淋巴细胞培养体系中加入IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT),检测T淋巴细胞增殖率及培养体系中IDO活性。结果MSCs培养传代3代以后的纯度达到95%。在无IFN-γ作用时,MSCs没有IDO mRNA表达,经不同浓度的IFN-γ诱导后,均可检测到IDO mRNA表达,且表达强度呈IFN-γ剂量依赖性;IDO蛋白的表达与IDO mRNA一致;随着IFN-γ浓度的增加,MSCs培养上清液中的色氨酸浓度降低,而犬尿氨酸浓度升高。在无MSCs的混合淋巴细胞培养体系中,T淋巴细胞的增殖率为(80.2±5.7)%,当MSCs与反应细胞之比为1:5、1:10、1:50及1:100时,T淋巴细胞的增殖率分别为(28.1±3.2)%、(38.6±4.0)%、(57.2±2.5)%和(84.1±4.6)%,若在相同的混合淋巴细胞培养体系中加入1-MT,则MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用基本消失;培养体系中IDO的活性与MSCs的数量成正比。结论γ干扰素在体外能诱导MSCs的IDO表达,其表达水平与γ干扰素呈剂量依赖性;IDO能抑制T淋巴细胞增殖。     

致敏供者淋巴细胞输注对受者免疫功能重建及移植物抗宿主病发生率的影响

目的探讨非清髓异基因外周血造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注(DLI)对受者免疫重建及移植物抗宿主病(GVHD)发生率的影响。方法以C57BL/6小鼠(H-2b)为受鼠, BALB/c小鼠(H-2d)为供鼠,建立异基因外周血造血干细胞移植模型(实验组),移植当天受者接受60Coγ射线全身照射,移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg。以不行造血干细胞移植,仅行γ射线全身照射和环磷酰胺腹腔注射的正常C57BL/6小鼠为对照。实验组存活小鼠在移植后第28天分别接受致敏供鼠淋巴细胞输注(n=8)、未致敏供鼠淋巴细胞输注(n=8),另有6只不输注供鼠淋巴细胞。移植后检测受者异基因嵌合率,观察GVHD的发生情况以及T淋巴细胞亚群变化,并行供受者间以及供受者与第三方小鼠(昆明鼠)间的单向混合淋巴细胞反应。结果实验组受鼠SRY基因均为阳性,嵌合率为(30.881±3.962)%。DLI后,接受未致敏DLI者均出现不同程度的GVHD,死亡3只(7.5%,3/8),而接受致敏DLI者无明显GVHD及死亡者。移植后45 d,接受致敏DLI者的CD8 T淋巴细胞明显高于正常C57BL/6小鼠(P<0.05),而接受未致敏DLI者的CD8 T淋巴细胞与正常对照的差异无统计学意义(P>0.05),至移植后60 d,接受DLI者的T淋巴细胞亚群接近正常(P>0.05);对照组T淋巴细胞亚群持续低于正常对照(P<0.05)。实验组小鼠淋巴细胞对供者淋巴细胞刺激的反应性均下降(P<0.01),以接受致敏DLI者最明显,而对昆明鼠淋巴细胞刺激的反应性维持正常水平。结论造血干细胞移植后输注致敏供者的淋巴细胞能促进受者的免疫功能重建,并可减少GVHD的发生。     

硬膜外阻滞对妊高征大鼠子宫、胎盘组织CD4+及CD8+T淋巴细胞的影响

目的观察硬膜外阻滞对妊高征（PIH）大鼠子宫、胎盘组织CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞的影响。方法健康雌性Wistar大鼠,鼠龄3～4个月,体重230～300g,40只孕鼠于孕14d时随机分为4组（n=10）：对照组（A组）、PIH组（B组）、假手术组（C组）、治疗组（D组）。B组、C组、D组采用皮下注射甲基L-精氨酸甲酯的方法制备PIH模型,25mg/次,2次/d,连续7d；A组相同时点给予等容量生理盐水0．25ml；C组行硬膜外导管置入术；D组行硬膜外导管置入术,每天由导管注入0．125%布比卡因50μl,连续7d。孕22d时处死大鼠,测定子宫、胎盘组织CD4^＋、CD8^＋及CD4^＋mRNA、CD8^＋mRNA的表达水平。结果各组CD4^＋表达和CD4^＋mRNA表达差异无统计学意义（P＞0．05）；与A组比较,B组、C组CD8^＋表达降低（P＜0．05）；与B组和C组比较,D组CD8^＋表达和CD8^＋mRNA表达升高（P＜0．05）。结论硬膜外阻滞可增加PIH大鼠子宫、胎盘组织CD8^＋T淋巴细胞。     

高表达Omi/HtrA2对PED/PEA-15表达缺陷前列腺癌细胞凋亡的影响

我们通过载体构建、转染和筛选，建立PED／PEA-15表达缺陷的前列腺癌亚克隆细胞系，探讨Omi／HtrA2与PED／PEA-15间的作用对前列腺癌细胞凋亡的影响，以阐明前列腺癌细胞凋亡机制。[第一段]