骨髓细胞凋亡在自血病化疗中的变化及意义

目的 观察骨髓细胞凋亡在白血病患者化疗过程中的动态变化，并探讨其临床意义。方法 用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的生物素化dUTP-x缺刻末端标记技术（tunel法）检测骨髓细胞涂片上凋亡细胞形态和数量的变化．结果 白血病患者骨髓凋亡细胞明显低于良性增生性贫血的病人，P〈0．001，化疗后能缓解、部分及完全缓解的病例凋亡细胞数较初诊有显著增加，P〈0．001。结论 骨髓凋亡细胞的数量随着白血病病情的缓解、复发、急变等病情的变化，而出现增高、减少、急剧减少的动态变化，掌握和检测这一动态变化将有助于评价和选择治疗药物，判定疗效及预后。     

Burkitt淋巴瘤细胞骨髓中形态学特征与组织病理学的比较分析

目的比较骨髓和组织所见的Burk itt淋巴瘤细胞的细胞形态与组织病理形态,尝试找出骨髓中Burk itt淋巴瘤细胞的形态特征,为今后在骨髓诊断Burk itt淋巴瘤作一探索。方法抽取病人骨髓涂片,经瑞氏染色、POX、PA S染色,以油镜观察细胞形态,并比较Burk itt淋巴瘤细胞在骨髓及组织的异同形态表现。结果骨髓中Burk itt淋巴瘤细胞可成堆及散在出现,核染色质细网状偏粗,胞浆深蓝色嗜碱性,可见多个嗜碱性蓝色核仁,背景细胞有巨噬细胞、单核细胞,淋巴细胞混在其中,与病理组织肿瘤细胞中出现反应性组织细胞的“星空”现象类似;病理组织肿瘤细胞中等大小,核圆形,有核仁,胞浆量中等,可见吞噬核碎片和凋亡细胞的反应性组织细胞,出现“星空”现象。结论骨髓中Burk itt淋巴瘤细胞及其背景具有一定的形态学特征,可作前驱性预诊,组织病理及免疫组化当然是确诊Burk itt淋巴瘤的金标准。     

不同条件下人骨髓基质细胞体外培养及诱导分化中的影响因素

目的:体外培养人骨髓基质细胞(humanmesenchymalstemcells,hM-SCs),传代、扩增、冻存复苏并诱导分化,为细胞移植及组织工程骨的构建奠定基础。方法:用酶消化-细胞单层培养法行细胞原代培养,传代扩增并冻存复苏,采用胰岛素和地塞米松进行诱导分化,碱性磷酸酶和钙化结节检测。结果:hMSCs可在体外培养,传代扩增并冻存复苏,并可诱导分化为成骨细胞。结论:可在体外分化为成骨细胞并钙化,可作为细胞移植及组织工程骨构建可靠的细胞来源。     

骨髓细胞形态学检查室间质控结果分析

卫生部临床检验中心开展的全国医院细胞形态学室间质评活动,从1999年开始,由发放血涂片改为发放彩图来回报结果。从彩图上指认各种细胞,颇有“纸上谈兵”的味道,现将我们近几年的工作体会总结如下。     

骨髓细胞来源的树突状细胞体外刺激T淋巴细胞增殖的研究

分离骨髓单核细胞,在一定的培养条件下将其诱导成树突状细胞,通过混合淋巴细胞反应检测这些树突状细胞的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力.     

自体富血小板血浆替代动物血清体外诱导培养人骨髓基质干细胞的实验

目的:用一种新的人骨髓基质干细胞培养方法,以满足细胞培养过程应中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入,达到组织工程骨临床应用中细胞的数量与生物学特性要求。方法:实验于2004-03/2005-03在南方医科大学组织工程实验室完成。①自体富血小板血浆的获取:将抽取的自体200mL,加抗凝剂混匀,两次离心。第1次在20℃,3000r/min离心10min。取上清及分界面下3mm部分置另一离心管中,第2次在20℃,以3600r/min离心15min。弃上层3/4余部分在旋涡振荡器上轻震荡使混匀,即为富血小板血浆。,剩将富血小板血浆与催化剂溶液(100g/L氯化钙、400IU/mL凝血酶)含以体积比9∶1混合,混匀后以0.22μm滤膜过滤即为富血小板血浆复合因子萃取液。②人骨髓基质干细胞的获取和培养:10名成年健康志愿者(排除其他系统疾病),男7名,女3名;15～35岁,平均年龄27.3岁。抽取骨髓5mL。将获得的有核细胞以2×10接种于10cm培养瓶(100mL/L72富血小板血浆配比低糖DMEM)培养。传代细胞用含100mL/L富血小板血浆,50mg/L抗坏血酸,1×10-8mol/L地塞米松,1×10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养,快速扩增后,采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察各细胞形态及细胞增值情况,碱性磷酸酶染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果:①人骨髓基质干细胞形态学观察结果:人骨髓基质干细胞接种后2～4h开始贴壁,24h后细胞完全贴壁,呈多角型、梭型。6～8d后,细胞可长满瓶底并呈现单层细胞融合。传代培养后细胞生长迅速,传代诱导后,接种细胞一两天可长满瓶底。细胞为长梭型或不规则多边形,并有伪足伸出,胞核位于细胞一端。细胞生长至第8代生长明显变缓,10代以后细胞内开始出现颗粒样沉积物,并有细胞脱落飘浮于液体中。扫描电镜观察,黏附细胞为梭型或多角型表现,并有多个突起呈不规则形状。②钙结节茜素红染色结果:第3代细胞培养融合后,继续培养至形成密集的细胞团簇,中心出现细胞基质的沉积,茜素红染色可以清晰的显示钙结节。③碱性磷酸酶染色:细胞诱导培养第3代后可见胞质内有大量灰黑色颗粒或块状沉淀,呈现碱性磷酸酶染色阳性。结论:①以自体富血小板血浆替代动物血清体外诱导培养人骨髓基质干细胞,碱性磷酸酶染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。②其所培养的细胞数量及生物学特性能快速达到临床应用的需求,是一种良好的培养方法。     

成纤维细胞生长因子18对体外培养兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响

目的:构建可稳定表达成纤维细胞生长因子18蛋白的真核表达载体,观察成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的影响。方法:本实验于2002-10/2004-03在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所及口腔医学院完成。①将pGEM-T-FGF18-3和pSecTag2B表达载体分别用KpnⅠ和NotⅠ酶切后重组pSecTag2B-FGF18质粒;ELISA检测转染后COS-7细胞上清的成纤维细胞生长因子18蛋白,以大于阴性对照A值2.1倍以上为阳性结果。②用细胞上清刺激骨髓基质干细胞,根据含小牛血清的DMEM不同比例稀释转染后COS-7细胞上清分为1∶2稀释组、1∶4稀释组、1∶8稀释组、1∶16组、1∶32稀释组;对照组∶用含体积分数为0.02小牛血清的DMEM培养液按1∶2稀释未转染的COS-7细胞上清。③通过酶动力法检测细胞碱性磷酸酶合成情况。结果:①成功构建了pSecTag2B-FGF18真核表达载体。②转染哺乳动物细胞COS-7用夹心ELISA法检测到了成纤维细胞生长因子18蛋白质的稳定表达,原液及1∶10稀释度细胞上清A值大于阴性对照A值2.1倍以上(P<0.01)。③用细胞上清刺激骨髓基质干细胞72h后,1∶2稀释组、1∶4稀释组、1∶8稀释组、1∶16组、1∶32稀释组骨髓基质干细胞A值较对照组明显增高(P<0.01),证实了成纤维细胞生长因子18对体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的促进作用。结论:成纤维细胞生长因子18有显著促进体外培养的兔骨髓基质干细胞碱性磷酸酶合成的作用,提示成纤维细胞生长因子18对于骨髓基质干细胞的分化及成骨表型的维持起着重要的调节作用。     

小鼠骨髓内破骨细胞诱导形成的实验观察

目的：建立骨髓间充质干细胞诱导培养成为破骨细胞的培养方法并进行初步的形态观察，为破骨细胞学及与其相关疾病的发病机制的研究提供更有意义的手段。方法：采用小鼠骨髓间充质干细胞通过1，25-(OH)2D3诱导分化为破骨细胞的培养方法，并观察原代成骨细胞对该方法破骨细胞形成及其功能的影响。根据是否加原代成骨细胞，分成未加成骨细胞、加成骨细胞二组，未加成骨细胞组是骨髓间充质干细胞直接诱导培养，加成骨细胞组是骨髓间充质干细胞与原代成骨细胞共同培养。分别培养6，9，12及15d，各组细胞到培养时间后取出进行TRAP染色阳性的多核细胞计数、骨片甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察。结果：未加成骨细胞、加成骨细胞两组的骨髓间充质干细胞经培养后均出现破骨细胞，而且随着培养时间的延长，破骨细胞及骨片吸收陷窝的数目增多。培养相同时间的未加成骨细胞、加成骨细胞两组之间的破骨细胞及骨片吸收陷窝的数目差异无显著性意义。结论：通过1,25-(OH)2D3诱导骨髓中的间充质干细胞培养破骨细胞的方法是可行的，而且骨髓间充质干细胞诱导培养成破骨细胞时加入原代成骨细胞共同培养对破骨细胞的形成和骨吸收功能并无明显促进作用。     

骨髓干细胞移植治疗运动神经元病的近期效果：72例疗效分析

目的：观察自体骨髓干细胞移植治疗运动神经元病的近期疗效，探讨对其功能改善作用。方法：200-02／10对经解放军第四六三医院神经内科临床确诊为运动神经元病的72例患者实施自体骨髓干细胞移植，围手术期给予营养神经等药物治疗。疗效评估以肌张力是否下降，言语不清、吞咽困难是否改善，抬头困难是否改善，肌束震颤次数是否减少，肌力是否增高为标准。如以上各项任何一种症状缓解即为有效。结果：5种症状均减轻者2例，任意4种症状得到缓解者6例，任意3种症状得到缓解者20例．任意2种症状得到缓解者28例，任意1种症状得到缓解者10例，所有上述5种症状均未得到缓解者6例。以上5种症状中的任何一种症状得到缓解均视为有效．有效率为92％(66／72)。无任何并发症出现。结论：自体骨髓干细胞移植具有改善运动神经元病功能障碍的可行性，近期疗效确切。     

不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。