约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析

目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白。方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIORAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱。凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性。未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀。选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织。疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等。结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CTP基因真核表达载体的构建

目的构建恶性疟原虫CTP 基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank 已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3. 结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中. 结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功.     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析

目的 制备恶性疟原虫（FCC1/HN株）融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体，分析其生物学特性及功能。 方法 用PfCP-2.9免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行融合，制备单克隆抗体，并分析其特性。 结果 获得1株能分泌抗PfCP-2.9的小鼠杂交瘤细胞株单克隆抗体F12D，经免疫球蛋白类型和亚类鉴定为IgG1。ELISA和蛋白质印迹法（Western blotting）显示单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，F12D所识别的PfCP-2.9抗原表位不能耐受还原剂巯基乙醇，表明F12D识别的是构象表位。间接免疫荧光试验（IFA）显示F12D可识别培养的FCC1/HN。体外抑制试验结果显示，F12D终浓度为0.3 mg/ml时，对FCC1/HN的抑制率为56%。 结论 单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，其所识别表位为构象表位，F12D可识别体外培养的FCC1/HN，并对其生长具有抑制作用。     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响

目的观察白细胞介素12 (IL-12) 对伯氏疟原虫(P.b)红内期感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响,探讨IL-12介导Th1/Th2免疫偏移在抗P.b红内期感染中的免疫调节作用.方法 BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b的红细胞,同时分别给予0.03 μg/d或0.15 μg/d IL-12处理,用ELISA方法检测P.b感染小鼠血清或脾淋巴细胞体外培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-4表达水平的动态变化.结果 0.03 μg/d IL-12处理组小鼠接种感染后第7天取脾淋巴细胞体外经PHA或可溶性抗原sAg刺激培养产生的IFN-γ水平较感染对照组显著升高,IL-4水平显著下降,而0.15 μg/d IL-12处理组脾淋巴细胞产生的IFN-γ及IL-4水平均较感染对照组显著下降.在感染后第3天,0.03 μg/d或0.15 μg/d IL-12处理组小鼠血清中IFN-γ均已出现,第5天达高峰,但感染后第7天 0.15 μg/d IL-12处理组血清中IFN-γ迅速下降,甚至低于感染对照组及0.03 μg/d IL-12处理组,感染对照组直到感染后第7天血清中方可检测到IFN-γ水平.结论适当低剂量IL-12诱导CD4 Th1免疫应答,产生细胞因子IFN-γ,以诱导抗P.b红内期感染的免疫保护作用;而较大剂量IL-12抑制机体抗感染免疫,甚至可致免疫病理损害.     

恶性疟原虫特异的质粒型DNA探针的制备

恶性疟原虫 DNA 与 pBR_(322)质粒 DNA 体外重组后,导入 E.coli HB_(101)建成基因文库,用疟原虫全基因组 DNA 从文库中筛出了5个杂交信号特强的克隆 pBF_1,pBF_2,pBF_3,pBF_4和 pBF_5。克隆 pBF_4 DNA与 P.c DNA,P.b DNA,及人白细胞 DNA 均无交叉反应,与 P.f DNA 杂交时,可检出的最低 DNA 量为10pg。     

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因的分子克隆与鉴定

目的: 为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供理论依据。方法: 根据MAD20 株裂殖子表面蛋白1 (MSP1) 和FC27 株裂殖子表面蛋白2 (MSP2) 基因编码区高度保守碱基设计并合成两对引物, 应用多聚酶链反应(PCR) 技术对5 例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕分离株CMH/YN 和云南省盈江县农场CYJ/YN 分离株基因组DNA MSP1 第13- 17 区基因和MSP2 基因进行扩增, 并将扩增产物分别经EcoRI 和KpnI, BamHI 和HindIII 双酶切后, 分子定向克隆M13mp18 和M13mp19 载体, 转染大肠杆菌(E. coli) TG1, 从含X-gal 和IPTG 的LB平板上, 将随机筛选得到的单个无色噬菌斑经E. coli JM 103 扩增, 用碱裂解法抽提重组子复制型DNA (RFDNA ) 后, 再分别经EcoRI 和KpnI, BamHI 和HindIII 双酶切鉴定。结果: 证实重组子为编码脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN 和CYJ/YN 分离株MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因分子克隆M13 载体。结论: 首次报道确证脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN 和CYJ/YN 分离株MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因分别与MAD20 株MSP1 和FC27 株MSP2 相应基因完全一致。这些发现对研究预防人脑型疟疫苗和建立一种新型脑型疟恶性疟原虫检测方法具有重要意义。     

进入疟疾研究的后基因组时代

恶性疟原虫基因组测序有望带来疟疾研究方法的革命。除了简单的基因发现,基因组测序将便于综合鉴定寄生虫发育阶段的基因表达、病理以及对药物治疗的宿主遗传背景等环境变量的反应。本文介绍了恶性疟原虫基因组测序计划的近况及功能基因组学开发的生物信息学及其分析工具的应用,其目的是根据对疟原虫生物学的深入观察,确定合理的、基于信息的、新的治疗策略和目标。     

人群TLR基因多态性与间日疟原虫感染的相关性

目的　比较间日疟原虫感染人群的Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）5、TLR9基因3个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点差异,探讨其与间日疟原虫不同感染类型的相关性。方法　收集中缅边境地区（云南省盈江县和缅甸拉咱市）2017—2019年间日疟原虫感染者202例及健康对照者104例,将上述研究对象分为无症状感染组、有症状感染组及健康对照组,其中无症状感染组与有症状感染组统称为感染组;采用飞行时间质谱分型技术检测以上研究对象TLR5、TLR9基因3个SNP位点,分析不同组之间TLR5、TLR9基因SNP位点等位基因和基因型的分布差异。结果　3组研究对象之间性别与年龄分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）;3组之间TLR9 1486C/T位点、TLR9 G1174A位点和TLR5 R392Stop位点的等位基因分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）;健康对照组与感染组间及健康对照组与无症状感染组间TLR9 1486C/T位点的AG基因型分布差异均有显著性统计学意义（P均＜0.05）;3组之间TLR9 G1174A位点、TLR5 R392Stop位点的基因型分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结论　TLR9 1486C/T位点的基因型多态性与间日疟原虫感染相关,但尚未发现TLR9 G1174A位点、TLR5 R392Stop位点与间日疟原虫感染的相关性,本研究结果可为揭示宿主基因多态性对间日疟原虫感染的影响提供重要线索。