METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用，为进一步明确METHI抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Ga14系统3，经PCR扩增子METH1的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后。再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段，该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物。可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

卡巴胆碱对多器官功能障碍综合征小鼠脏器功能和结构的保护作用

目的:观察卡巴胆碱(carbachol,Car)对酵母多糖致多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠多脏器功能和结构损伤的防护作用。方法:采用腹腔注射酵母多糖的方法复制小鼠MODS模型。雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(n=10),MODS 6、24、48 h组(n=30)和MODS Car 6、24、48 h防治组(n=30)。MODS组在致伤后腹腔注入生理盐水;MODS Car防治组在致伤前24 h内分3次灌胃注入卡巴胆碱。观察酵母多糖致伤后早期(48h内)动物死亡率,检测各组血丙氨酸转氨酶活性、尿素氮和肌酐水平,镜下观察致伤后48 h动物肝、肺、肾、心等脏器的组织病理学改变。结果:在酵母多糖致伤后48h内,MODS组小鼠死亡率达26.6%,MODS Car防治组的小鼠死亡率为10.0%。MODS组小鼠血浆ALT、BUN和Cr在伤后6h升高,而同时间点经卡巴胆碱预处理的小鼠血浆ALT、BUN和Cr仅略有升高,明显低于MODS组。光镜下观察发现,MODS组小鼠肝脏、肺脏、肾脏和心脏发生明显的病理改变,主要表现为脏器实质细胞浊肿、变性,间质充血、水肿和炎性细胞浸润,而卡巴胆碱防治组小鼠上述病变明显减轻。结论:预防性给予卡巴胆碱可以降低MODS急性期动物的死亡率,减轻脏器功能和结构的损伤,对急性炎症期的脏器损伤具有保护作用。     

葡萄糖对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

在30L发酵罐中研究了初始葡萄糖质量浓度和补料方式对光滑球拟酵母WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响．实验确定116.4g/L左右是较为适宜的初始葡萄糖质量浓度,发酵58h时丙酮酸质量浓度和产率分别为58.0g/L和0.516g/g．采用初始葡萄糖质量浓度为53.4g/L,发酵24h分批补料至葡萄糖总质量浓度为115g/L的培养方式,发酵64h时丙酮酸质量浓度和产率分别为60.2g/L和0.559g/g;采用初始葡萄糖质量浓度为62.6g/L,发酵24h开始连续补料至葡萄糖总质量浓度为115g/L的培养方式,发酵72h时丙酮酸质量浓度和产率分别为63.3g/L和0.586g/g,与葡萄糖总质量浓度相似(115g/L)的分批发酵相比,丙酮酸产量分别提高了3.8%和9.1%．实验结果表明适宜的初始葡萄糖质量浓度能促进光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸;尽管葡萄糖补料培养可适度提高丙酮酸的产量及产率,但生产强度却有所下降．     

法夫酵母色素的组成与性质

对法夫酵母色素的组成及其光谱特性和稳定性进行了研究.结果表明法夫酵母色素是由10多种类胡萝卜素组成,其中虾青素为78%;色素呈亮丽的红色,对热较敏感,对自然光、紫外光、氧很敏感,色拉油和抗氧化剂对其有一定的保护作用.     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用,为进一步明确METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Gal4系统3,经PCR扩增子METH1的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段,该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物,可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

抑制大鼠脑缺血再灌注损伤中GSK-3β活性对自噬的影响及可能机制

目的：探讨大鼠缺血再灌注损伤中抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）后对自噬的影响及如何通过酵母自噬启动ATG1激酶同源蛋白（Unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1）影响自噬的机制。方法：实验选取SD大鼠为研究对象,分为假手术组（Sham 组,仅结扎颈内动脉）、缺血再灌注组（MCAO 组,大脑中动脉栓塞术制备局灶脑缺血再灌注模型）、GSK-3β干扰片段组（siGSK-3β组,建模前24 h注射GSK-3β干扰片段）、GSK-3β无意义序列组（ConsiGSK-3β组,建模前24 h注射无意义序列）、GSK-3β抑制剂组（SB216763组,建模前6 h注射抑制剂SB216763）,每组5只。免疫印迹检测大脑皮质酪氨酸216号位点磷酸化GSK-3β[GSK-3β（P-tyr216）]、自噬相关蛋白轻链3抗体Ⅰ/Ⅱ（autophagy microtubule-as－sociated protein light chain 3 antibodyⅠ/Ⅱ,LC3BⅠ/Ⅱ）、泛素结合蛋白（sequestosome 1,P62）、磷酸化ULK1（phosphorylated ULK1,P-ULK1）、乙酰化ULK1（acetylated ULK1,AcK）的表达,电镜显示自噬体数量。结果：与Sham组比较,MCAO组中GSK-3β（P-tyr216）增高（P=0.000）。siGSK-3β、SB216763组相较MCAO组,LC3BⅡ/LC3BⅠ升高（P=0.000）、P62表达下降（P=0.000）、P-ULK1表达增高（P=0.000）、AcK表达下降（SB216763：P＜0.05;siGSK-3β：P＜0.01）,电镜可见自噬小体。结论：在脑缺血再灌注损伤中,GSK-3β活性抑制后可通过磷酸化ULK1增强细胞自噬。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

胃癌细胞中SerpinB5与MAFbx的相互作用及其作用位点研究

目的 探讨胃癌细胞中SerpinB5能与MAFbx的相互作用及其作用位点.方法 采用酵母双杂交及免疫共沉淀方法检测SerpinB5与MAFbx之间的相互作用.分别用RNA干扰及瞬间转染pGBKT7-SerpinB5调节SerpinB5表达水平.在胃癌细胞株SUN-16中研究SerpinB5对MAFbx表达的影响.用同源建模的方法构建出MAFbx的结构信息;并以分子对接的手段来预测SerpinB5与MAFbx相互作用的位点.结果 酵母双杂交及免疫共沉淀均证实SerpinB5能与MAFbx相互作用;MAFbx的表达水平随着SerpinB5的表达水平变化而变化.同源建模和分子对接的方法预测SerpinB5与MAFbx蛋白相互作用的关键残基是PR0261、ASN361和LYS362.结论 胃癌细胞中SerpinB5能与MAFbx相互作用,且SerpinB5上的PR0261、ASN361、LYS362残基是其与MAFbx蛋白相互作用的可能位点.     

长链胰岛素样生长因子1在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

目的:在毕赤酵母KM71中分泌表达长链-Arg3-胰岛素样生长因子1(LR3IGF-1),并探讨其体外生物活性.方法:人工合成LR3IGF-1基因,构建表达载体pCαA-LR3IGF-1,转化毕赤酵母KM71.筛选重组工程菌株,经诱导表达并从上清中纯化目的蛋白,鉴定其生物活性.结果:诱导上清中存在一8×103 左右的条带,经初步鉴定为目的蛋白条带.每升培养基经纯化后能得到40 mg目的蛋白.纯化后的目的蛋白具有明显的体外刺激NIH 3T3细胞增殖的作用.结论:建立了LR3IGF-1在毕赤酵母 KM71中表达及纯化方法,该方法能获得具有生物学活性的高纯度LR3IGF-1,为LR3IGF-1的后续研究及临床应用奠定了基础.     

用固定化生长微生物细胞改善氨基酸调味液品质

利用固定化生长的酵母细胞和黑曲霉菌丝体 ,对酸法水解的氨基酸水解液进行发酵 ,除去水解液异臭味 ,使调味液的口味和风味得到明显改善 ,产品既有氨基酸调味液的特点 ,又具有酱油的风味