益肾阴方地子丸对早期糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用

目的:观察自拟益肾阴方地子丸对早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型大鼠的空腹血糖、肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白及β2-微球蛋白的影响。方法:采用高脂乳灌胃8周联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ,30 mg·kg~(-1))诱导糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,DM成模后继续观察,当大鼠24小时尿微量白蛋白水平达到30 mg,为早期DN模型复制成功。将模型大鼠分为正常组、模型组、地子丸组、阳性对照组(二甲双胍联合厄贝沙坦),分别给予相应药物经口灌胃干预,正常组与模型组则给予等体积生理盐水,连续治疗8周。实验结束时检测大鼠空腹血糖、24小时尿微量白蛋白、血β2-微球蛋白、肌酐、尿素氮、肾脏指数等指标;HE染色后观察每组大鼠肾脏组织的病理学形态变化。结果:与模型组比较,阳性对照组大鼠空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)在实验第2周末明显下降(P0.05),地子丸组大鼠FBG在实验第6周末明显下降(P0.05)。与模型组比较,地子丸组与阳性对照组大鼠24小时尿微量白蛋白在实验第4周末明显减少(P0.05),地子丸组和阳性对照组大鼠β2-微球蛋白水平显著降低(P0.01),肾脏指数呈现显著降低趋势(P0.05)。与模型组比较,地子丸组和阳性对照组大鼠尿素氮水平均降低(P0.05)。肾脏组织形态学方面,与模型组比较,地子丸组与阳性对照组肾脏肿胀程度明显减轻,表面颜色正常、偶见出血点,肾小球仅见部分的节段性增生,局部系膜基质增生。结论:地子丸可有效控制早期DN大鼠的血糖水平,减少尿微量白蛋白的排泄,减轻肾小球超微结构的损害。     

基于一测多评法对白芍中5种化学成分质量控制研究

目的:建立同时测定白芍中5种化学成分含量的一测多评法(quantitative of multi-component with a single-marker,QAMS)。方法:采用高效液相色谱法,SunFire?C_(18)(4.6 mm×250.0 mm,5μm)色谱柱,流动相乙腈(A)-(体积分数)0.05%磷酸水溶液(B)梯度洗脱,检测波长230 nm,流速1.0 mL·min~(-1),柱温30℃。以芍药苷为内标物,计算没食子酸、芍药内酯苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷的相对校正因子?_(i/s)值。分别考察相对校正因子对不同色谱柱、仪器、柱温、流速、实验人员、流动相pH和检测波长的耐用性。比较外标法和QAMS法测定的40批白芍样品中芍药苷等5种化学成分含量,验证QAMS法的准确性和可行性。结果:不同检测波长(230±2)nm对相对校正因子?_(β-PGG/芍药苷)和?_(没食子酸/芍药苷)的影响及流动相磷酸水的体积分数(0.01%～0.10%)对?_(β-PGG/芍药苷)的影响均十分明显(RSD5.0%),其他因素对各相对校正因子影响不大(RSD5.0%);相对校正因子的重复性和耐用性良好(RSD5.0%);相对校正因子?_(没食子酸/芍药苷)=2.16,?_(芍药内酯苷/芍药苷)=0.81,?_(β-PGG/芍药苷)=2.17,?_(苯甲酰芍药苷/芍药苷)=1.92。8批趁鲜切制饮片和32批润切饮片中5种化学成分的QAMS含量值与外标实测值之间相对偏差均5.0%,无明显差异。结论:以芍药苷为内标物,同时测定白芍中没食子酸、芍药内酯苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷等5种成分含量的一测多评法重复性好,结果准确,可为白芍饮片的质量控制提供参考。     

一种核酸适配体高敏检测方法的建立及应用评价

本文建立一种基于免疫印迹的核酸适配体高敏定量分析的检测方法,并探讨其在适配体药物靶向性研究中的应用价值。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行核酸适配体的分离,然后利用电转的方法将凝胶上的核酸适配体转移至PVDF膜上,先后孵育Rabbit Anti-Biotin和HRP-Streptavidin抗体,最后利用化学发光仪进行成像。结果显示核酸适配体可以通过该方法进行定量检测分析,且该方法检测灵敏度高,能够识别荧光染料法检测不到的浓度范围。此外,该方法只识别被生物素修饰的核酸适配体,特异性强。结果提示,核酸免疫印记法可以作为核酸适配体药物靶向性研究的一个定量检测手段。     

DC靶向适配体修饰的载铜绿假单胞菌DNA疫苗递送系统的构建及体外评价

构建了一种DC靶向适配体修饰的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)DNA疫苗递送系统。采用乙醇注入法制备阳离子脂质体,静电吸附法制备载pVAX1-OprF-VP22的阳离子脂质体(Lip-pOprF-VP22),探讨不同DOTAP/pDNA质量比的Lip-pOprF-VP22对pVAX1-OprF-VP22的包封效果、对DC2.4的细胞毒性及转染率,筛选最佳质量比的Lip-pOprF-VP22测定其粒径及Zeta电位;后插法制备DC靶向适配体修饰的载pVAX1-OprF-VP22的阳离子脂质体(Apt-Lip-pOprF-VP22),检测其转染DC2.4后OprF蛋白的表达量及对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)成熟的影响。结果表明,Lip-pOprF-VP22随着DOTAP/pDNA质量比增加包封率逐渐增加,当质量比为5∶1时即能很好的包封pVAX1-OprF-VP22;当Lip-pOprF-VP22作用于DC2.4 24 h或48 h后,不同质量比的Lip-pOprF-VP22对DC2.4的存活率均在80%以上;当DOTAP/pDNA质量比由2∶1增加到10∶1,转染率表现为先增加、后降低的趋势,其中DOTAP/pDNA质量比为4∶1、5∶1时转染率相对较高;当DOTAP/pDNA质量比为5∶1时,Lip-pOprF-VP22粒径为(171.67±1.27)nm,Zeta电位为(11.30±0.57)mV;Apt-Lip-pOprF-VP22转染DC2.4后可表达更多OprF蛋白且可明显促进BMDCs的成熟。     

补肾利湿活血汤治疗特发性少弱精子症

目的:观察补肾利湿活血汤治疗特发性少弱精子症的临床疗效并初步探讨其作用机制。方法:将82例特发性少弱精子症患者随机分为治疗组和对照组,其中治疗组42例,对照组40例。治疗组给予补肾利湿活血汤口服,对照组给予五子衍宗软胶囊口服。两组均连续治疗3个月后评价临床疗效,比较两组患者治疗前后精子密度、a级精子活率、(a+b)级精子活率、精子活动率及精浆锌含量。结果:治疗组临床有效率为85.71%,对照组有效率为67.5%,两组比较,差异有统计学意义(P0.05)。两组治疗后精子密度、a级精子活率、(a+b)级精子活率及精子活动率均较治疗前明显改善,且治疗组均优于对照组(P0.05)。两组治疗后精浆锌含量均升高,治疗组均显著优于对照组(P0.05)。结论:补肾利湿活血汤治疗特发性少弱精子症疗效显著,可增加精子密度,提高精子活力,其作用机制可能与提高精浆锌含量有关。     

小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

目的 探讨类固醇受体辅活化子（SRC）-3蛋白在脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中的作用.方法 健康SPF级雌性野生型（SRC-3＋/＋）小鼠、SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠各5只,分别分离和原代培养腹腔巨噬细胞,并相应分为SRC-3＋/＋组和SRC-3-/-组.收集并调整细胞浓度为1×106/ml,接种于6孔板,1 ml/孔,给予10 μg/ml LPS刺激,分别在刺激前（0 h）、刺激后4 h和12 h收集腹腔巨噬细胞.通过Western blot测定腹腔巨噬细胞Toll样受体4（TLR4）的表达,并通过transwell趋化实验和中性红吞噬实验,分别测定腹腔巨噬细胞的趋化指数（CI）和吞噬功能.结果 LPS诱导前两组腹腔巨噬细胞TLR4的蛋白表达和CI差别无统计学意义,但SRC-3-/-组的吞噬功能显著低于SRC-3＋/＋组（P＜0.01）;无论是SRC-3＋/＋组,还是SRC-3-/-组,LPS诱导4 h和12 h后,两组腹腔巨噬细胞TLR4的表达和CI均显著增高（P＜0.01）,但在相应时间点,SRC-3-/-组与SRC-3＋/＋组相比差别无统计学意义.LPS刺激4 h后,两组吞噬功能均显著增加（P＜0.01）,但SRC-3-/-组增加的程度显著低于SRC-3＋/＋组（P＜0.01）;相反,LPS刺激12 h后,两组吞噬功能均受到不同程度的抑制（P＜0.05或P＜0.01）,且SRC-3-/-组较SRC-3＋/＋组抑制的程度更低（P＜0.01）.结论 SRC-3调节腹腔巨噬细胞的先天性免疫功能可能与吞噬功能有关,而与其趋化功能无关.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖环境下体外小鼠足细胞活性氧的影响

目的　观察不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对高糖造成氧化应激状态下体外小鼠足细胞损害的作用并探讨其机制。 方法　以高糖（25 mmol/L）培养的小鼠足细胞为研究对象,维生素E培养为对照。首先以MTT法检测细胞活力,再在激光共聚焦显微镜下以CM-H2DCFDA荧光探针观察不同浓度EGCG（0.2、10、100 μmol/L）刺激足细胞6、12、24 h后活性氧（ROS）生成,并以流式细胞仪定量分析ROS平均荧光强度。RT-PCR法检测足细胞内ROS产生的主要通路NADPH氧化酶各亚基mRNA（ph22phox、p47phox、p67phox）的表达。 结果　高糖刺激下6 h,足细胞ROS生成显著增加（P < 0.01）。正常糖组和甘露醇组培养12 h ROS生成无显著增加（P > 0.05）。EGCG 0.2 μmol/L作用6 h可显著降低高糖环境下体外小鼠足细胞ROS水平（P < 0.01）。与高糖组比较,EGCG（100 μmol/L）显著减少NADPH氧化酶亚基p22phox和p67phox mRNA表达（均P < 0.05）。与维生素Ｅ组比较,EGCG（0.2 μmol/L）和维生素E（0.2 mmol/L）协同作用组显著减少p47phox mRNA表达（P < 0.05）。 结论　EGCG能缓解高糖环境下体外足细胞氧化应激状态,对高糖培养下足细胞有保护作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯延缓软骨细胞衰老的相关研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）能否延缓软骨细胞衰老及其作用机制。方法 取4周龄SPF级SD大鼠关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶分步消化法分离培养软骨细胞并传代。经甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色鉴定后,将第2代细胞分为空白对照组、10 ng/mL IL-1β培养组以及6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培养组,对应培养24 h后采用细胞计数试剂盒8观测软骨细胞活性,筛选EGCG最佳药物浓度进行下一步实验。进一步将第2代软骨细胞分为空白对照组（A组）、10 ng/mL IL-1β培养组（B组）、EGCG+10 ng/mL IL-1β共培养组（C组）、EGCG+10 ng/mL IL-1β+5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组（D组）,对应培养后采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度,单丹磺酰尸胺法检测细胞自噬情况,实时荧光定量PCR检测软骨细胞衰老相关基因[Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3(m...     

原生质体融合技术选育高效菌株降解聚乙烯醇

从自然界中分离聚乙烯醇(PVA)的降解细菌，经紫外线诱变，得到两株具有单重抗药性的突变菌株S7(Str^s，Kan^r)和K15(Str^r，Kan^s)，两者对PVA的去除率分别达到52％和58％．将S7和K15作为亲本菌株进行原生质体融合，并对融合条件进行优化，融合子F4菌株对PVA去除率达到79．9％，将其培养成活性污泥后，PVA去除率可达87％，是普通活性污泥的三四倍．     

环磷酰胺诱导少精子/无精子症大鼠模型所致睾丸、附睾IGF-I的变化

目的:探讨环磷酰胺(CP)对大鼠附睾和睾丸组织中胰岛素样生长因子I(IGF-I)表达的影响;方法:96只8周龄成年雄性SD大鼠,分为6组,每组16只。第1~5组分别给予CP 10、20、40、80、100 mg/(kg.d),第6组为对照组,给予生理盐水2 m l。胃管给药2周和4周后,处死大鼠,采用ELISA法对附睾组织洗脱液IGF-I进行定量检测;同时采用SP免疫组化法检测睾丸组织IGF-I的表达。结果:随着CP处理时间的延长和剂量的增加,IGF-I在大鼠附睾中的浓度逐渐下降,大鼠睾丸组织中IGF-I的表达也降低。结论:CP在引起大鼠少精子/无精子症的同时,可以显著降低大鼠附睾、睾丸IGF-I的含量和表达水平。IGF-I的降低与CP降低大鼠生精功能明显相关。