PLGA纳米载体介导的端粒酶反义核酸体外转染率及对肝肿瘤细胞的影响

目的通过以PLGA纳米粒作为端粒酶hTEKT反义核酸的载体，促进反义核酸对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法用绿色荧光蛋白报道基因pEGFP—N1表达质粒DNA转染细胞；观测不同转染方法的转染率，TRAP—ELISA法检测端粒酶活性；噻唑蓝（MTT）法测定端粒酶反义核酸对肝肿瘤细胞HepG2的抑制；过氧化物酶的抗荧光素抗体法检测肿瘤细胞凋亡指数。结果裸DNA和磷酸钙的转染效率均不高，分别为18％和24％；脂质体的转染效率为42％，纳米粒的转染效率最高，达61％；以脂质体或PLGA纳米粒为载体介导端粒酶反义核酸处理的肿瘤细胞，其端粒酶活性和生长与空白对照相比明显下降（P〈0．05），两种载体之间的差异也非常显著（P〈0．05）；处理72h后，纳米粒介导组的肿瘤细胞凋亡率显著高于脂质体介导组，分别为23．1％和16．4％。结论PLGA纳米粒是一种非常有前途的非病毒基因治疗载体。     

MAGE-3基因片段真核表达质粒的构建

目的克隆人MAGE-3基因片段，以构建真核重组表达质粒pcDNA3-1-MAGE-3，为制备以MAGE-3基因片段为基础的核酸疫苗及探讨相关的肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法RT—PCR法从肝癌组织制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的MAGE-3基因片段，pGEM-TEasy为克隆载体，pcDNA3，1为真核表达载体，采用DNA重组技术，将目的基因先克隆至pGEM—TEasy载体再亚克隆至pcDNA3．1载体上，然后，据氨苄青酶素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、克隆鉴定引物T7／SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆pcDNA3．1-MAGE-3中的插入序列进行DNA测序。结果扩增出了MAGE-3目的基因片段；经蓝白筛选实验、克隆鉴定引物扩增方法鉴定得到重组子pGEM—T—MAGE-3；引物扩增方法鉴定得到重组子pcD—NA3，1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较，结果完全一致。结论成功构建了重组pcDNA3．1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗，为肿瘤免疫治疗提供了条件。     

多西他赛磁微球的制备

目的制备抗肿瘤载体药物多西他赛磁微球，为进一步动物实验和临床应用奠定基础。方法采用自制纳米四氧化三铁颗粒7mg，多西他赛5mg，人体血清α1-酸性糖蛋白15mg经油酸乳化交联混合而成。结果制备的多西他赛磁微球形态理想，粒径微小，直径约20～30nm，其磁响应性良好，符合静脉输注靶向给药的要求。结论该方法制备多西他赛磁微球简便易行，方法可靠，是磁靶向治疗实体肿瘤进一步研究的新希望。     

缺陷型TGF_1βⅡ型受体真核表达质粒载体的构建

目的:本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGF1βⅡ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGF1βⅡ型受体缺陷而阻断TGF1β的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料。方法:根据大鼠肝组织TGF1βⅡ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证。结果:运用分子生物学技术,成功获取突变体TGF1βⅡ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需。结论:TGF1βⅡ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择。     

中西医结合治疗周围动脉硬化闭塞性疾病

目的:观察灯盏花注射液和前列地尔脂微球载体制剂Lipo PGE1注射液治疗周围动脉硬化闭塞症(PAOD)的疗效.方法:选择PAOD患者66例随机分为西医对照组33例,治疗组33例.对照组给予Lipo PGE1注射液10μg静脉滴注,1次/d,14d为1个疗程.治疗组给予灯盏花注射液40ml和Lipo PGE1注射液10μg静脉滴注,1次/d,14d为1个疗程.观察临床疗效、监测血流变学等五项指标;超声多谱勒测量两组治疗前后下肢动脉狭窄处狭窄直径及血流峰速及踝/肱指数(ankle arm index,AAI).结果:治疗组显效率为84.85%,对照组为57.58%(P＜0.05];治疗组各方面指标改善均优于对照组(P＜0.05).结论:灯盏花注射液和前列地尔脂微球载体制剂Lipo PGE1注射液合用能显著改善PAOD患者血流变学异常,解除血管痉挛,增加组织灌流量,改善肢体缺血症状.     

浙江省2003～2004年甲副伤寒菌株质粒图谱分析

目的：探讨浙江省2003、2004年不同地区分离的甲型副伤寒菌株质粒基因定位及与致病性的关系。方法：利用快速小量质粒提取技术及电泳图谱方法，对浙江省2003、2004年暴发点病人和住院病人分离的部分甲型副伤寒菌株进行质粒图谱分析并做药敏试验。结果：分析发现选择的78株菌株中，78株(100％)对红霉素(ETM)耐药，77株(98．72％)对利福平(RFP)、链霉素(SM)及头孢拉定(CV)耐药，76株(97．44％)对羧苄青霉素(CAR)及磺胺(SD)耐药，64株(82．05％)对强力霉素(DC)耐药；大多数菌株带有一20kb大小质粒，所有菌株均带有2．2kh大小的质粒。结论：甲型副伤寒菌对ETM、RFP、CAR、CV、SM、SD、DC耐药，并认为具有多重耐药性是浙江省甲型副伤寒发病率持续高发的主要原因。     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

反义GAcDNA重组质粒的构建及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的 构建含GA反义基因的重组质粒，研究GA反义基因对结肠癌细胞生物学性状的影响，为利用GA反义基因治疗肿瘤提供依据。方法 应用基因重组技术构建含GA反义基因的重组质粒pcDNA3．0／GA，通过脂质体法转染人结肠癌细胞DH5α，MTT法、电镜观察等方法检测GA反义基因对结肠癌细胞生物学性状的影响。结果获得含GA反义基因的pcDNA3．0／GA，转染结肠癌细胞DH5α后，结肠癌细胞生长速度明显减慢，细胞超微结构呈典型的凋亡改变。结论 GA反义基因可抑制肿瘤细胞内GA基因的表达，使细胞内GA活性下降，并导致肿瘤细胞利用Gln障碍，最终使肿瘤细胞生长受抑制。     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5'侧序列通用表达载体的构建

目的: 检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动BglⅡ效果及构建真核表达载体pcDNA3.1-65.方法: 采用SalⅠ和BamHⅠ对pMD-T/65双酶切,得到6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列;将启动子片段插入到XhoⅠ和BglⅡ双酶切后的pGL3-Basic载体里;获得重组报告基因载体pGL3-B65.瞬时转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞,检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动效果.将β-酪蛋白基因5′侧序列插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的XhoⅠ和BamHⅠ位点之间,从而获得载体pcDNA3.1-65.结果: 长度为6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列能有效地启动荧光素酶报告基因,并正确构建了真核表达载体pcDNA3.1-65.结论: 克隆的β-酪蛋白基因5′侧序列在转录水平上具有生物学功能,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了坚实的基础.