生物信息学在病毒学研究中的应用

本文介绍生物信息学的基本概念、中心任务和研究目标，阐述了近几年来生物信息学在病毒学研究中发挥的主要作用，并对其今后的研究前景作了展望，同时提出了一些亟待解决的问题。     

流体切应力作用强度对内皮细胞IL-8生成的影响

血管内皮细胞衬于血管腔的表面，是血流机械应力的主要感受者。切应力可以直接调节内皮细胞生物活性物质的合成和分泌，其中包括诱导内皮细胞生成IL-8，而且IL-8的生成量与切应力作用时间有关。为阐明内皮细胞IL-8的生成除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关，我们用不同强度的流体切应力(2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne／cm^2)处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用双抗体夹心ABC-ELISA技术检测内皮细胞IL-8蛋白质的生成。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成；切应力处理内皮细胞后，低切应力(2．09dyne／cm^2)时IL-8蛋白质生成量明显增加，约为高切应力(18．32dyne／cm^2)时IL-8蛋白质生成量的6(作用5h)或7倍(作用6h)。IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系；直线回归方程：5h时为y=760．12—36．06x，相关系数7=-O．978；6h时为y=781．87—36．66x，相关系数7=-O．980。式中：y为切应力作用下内皮细胞IL-8的生成量；x为施加于内皮细胞的切应力强度(dyne／cm^2)。不同的切应力作用时间(5h、6h)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力强度的变化规律。提示流体切应力诱导内皮细胞生成IL-8的量，不仅与切应力的作用时间有关，而且IL-8的生成量与切应力强度有关。流体低切应力诱导内皮细胞IL-8的生成量急剧增高，可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

克罗恩病患者与健康人血清蛋白质组学比较初步研究

目的：应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法: 采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例，用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE)，并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 鉴定和生物学信息分析。结果: 通过2-D DIGE分析，发现了克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点，质谱分析和数据库检索共鉴定出22种蛋白质，包括SER/THR，CD45，APC等。结论: 蛋白质组学能很好显示克罗恩病患者与正常人血清蛋白质表达差异，本研究鉴定的蛋白质可能为研究克罗恩病的生物学行为提供新的分子标记物。     

卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与鼠 HSP70 融合蛋白的构建、表达及鉴定

 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与小鼠热休克蛋白 70（mHSP70）融合蛋白 6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。 方法 根据 Genebank 上已发表的 mHSP70 基因序列（NM_010478）合成引物行 PCR 扩增,以扩增所得 mHSP70 基因插入 pET30a（+）-6B11ScFv 质粒后转化入 E.coli DH5α,获得 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒。将鉴定正确的 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒转化入 E.coli BL21（DE3）,获得 E.coli BL21（DE3）[pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并行 SDS-PAGE 分析,对表达产物进行复性和 Ni2+-NTA 柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和 ELISA 方法进行鉴定和免疫活性检测。 结果 6B11ScFv/mHSP70 融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE 分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达 20.9%,蛋白纯度达 95% 以上。蛋白质印迹分析证实 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白相对分子质量为 104 000,ELISA 检测表明其具有 6B11ScFv 和 mHSP70 的免疫 活性。 结论 构建表达的 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。     

皮肤角朊细胞与表皮干细胞双向电泳图谱的建立及差异分析

目的 建立皮肤角朊细胞与表皮干细胞的双向电泳图谱,并分析二者表达蛋白质的差异,为进一步研究体外调控表皮十细胞的增殖、分化提供线索.方法酶消化法获取单个表皮细胞悬液.Ⅳ型胶原快速贴壁法分选表皮干细胞.利用舣向电泳技术(2-DE)建立两种细胞的蛋白质表达图谱,并用Imagemaster 2D elite 5.0软件分析两种细胞的差异表达蛋一点.结果两种细胞的2-DE蛋白表达谱具有良好的重复性和可比性.皮肤角朊细胞与表皮干细胞的电泳图谱平均蛋白质点数分别为(982 ±18)个和(930 ±15)个,匹配点数为(850±13)个和(798±11)个,匹配率是86.56%和85.81%;两种细胞蛋白质间匹配点数是(886 ±8)个,匹配率是76.98%.找到差异蛋白点11个,其中只在表皮下细胞中表达或高表达的有8个;只在皮肤角朊细胞中表达或高表达的有3个.结论利用双向电泳法得到了分辨率较高儿重复性好的皮肤角朊细胞与表皮干细胞蛋白质组图谱,且二者存在有一定的差异.     

Effect of structural domain Ⅱ of HCV 5' noncoding region on its translation initiation activity

Objective To examine the role of domain Ⅱ of hepatitis C virus(HCV) 5'noncoding region (5'NCR) in its translation initiation activity. Methods The fragment of HCV 5' NCR with deletions of 5'-proximal 118 nucleotides were amplified with PCR, then was used to substitute for the full length HCV 5'NCR of plasmid pCMVNCRIuc, a firefly luciferase(Flue) eukaryotic expression plasmid regulated by HCV 5' NCR, to generate recombinant plasmid pCN1-d3, pCMVNCRIuc, pCN1-d2 (modified pCMVNCRluc with deletions of HCV 5' NCR nt1-43) and pCN1-d3 were transfected into HepG2 cells with liposome transfection protocol, respectively, and the relative luciferase activity was measured to analyze the regulatory effect of the truncated 5'NCR on Fluc gene expression. Meanwhile the Fluc mRNA levels were detected by RT-PCR. Results The recombinant plasmid was successfully constructed. The Fluc mRNA levels of the 3 plasmids were not significantly different(P 0.05), and there were also no significant difference between the relative luciferase activity of plasmids pCN1-d2 and pCMVNCRluc(P 0.05). However, that of pCN1-d3 was decreased significantly(P < 0.01, compared with pCN1-d2 or pCMVNCRluc). Conclusion Structural domain Ⅱ of HCV 5' NCR plays an important role in itstranslation initiation activity.     

不同部位黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤中染色体的异常及其意义

目的 探讨不同部位黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)中t(11;18)/APl2-MALT1、t(1;14)/IgH-bcl-10、t(14;18)/IgH-MALT1和其他遗传学异常的发生情况及其意义.方法 收集196例不同部位的MALT淋巴瘤,包括胃53例[其中9例有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)成分]、眼眶50例、涎腺20例、肺20例、肠17例、皮肤17例、肝脏8例、甲状腺5例和其他部位6例(包括舌根2例,胰腺、喉、声带和肾脏各1例),用荧光原位杂交(FISH)分别检测APl2-MALT1、bel-10、MALT1和IgH基因的异常.结果 在196例MALT淋巴瘤中,APl2-MALT1融合基因共检出25例(12.8%).但是在不同部位,阳性率差异有统计学意义(P=0.002):从高到低依次为肺(45.0%,9/20)、不伴DLBCL成分的胃MALT淋巴瘤(22.7%,10/44)、涎腺(15.0%,3/20)、肠2/17、眼眶2.0%(1/50).而在伴DLBCL成分的胃MALT淋巴瘤、皮肤、甲状腺、肝脏和其他散发部位均未发现APl2-MALT1融合基因.在196例中,1例肺MALT淋巴瘤同时显示IgH基因和MALT1基因异常,可能是t(14;18)/IgH-MALT1异常.3例(2例不伴DLBCL成分的胃和1例肺)同时显示IgH基因和bcl-10基因异常,可能是t(1;14)/IgH-bcl-10异常.此外,用MALT1基因探针检测中,6例(2例涎腺、2例肝脏、1例伴DLBCL成分的胃和1例甲状腺)可能为18号染色体3体;3例(2例胃和1例肠)为MALT1基因扩增.结论 在MALT淋巴瘤中特异性的染色体异常发生率较低,但在不同部位,这些异常发生率存在差异.该现象提示发生在不同部位的MALT淋巴瘤,尽管组织形态学特点类似,但可能具有不同的发病机制.     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。     

红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。