三种方法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白转染效率的比较

 目的 比较超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的转染效率。方法 用摇床过夜摇pMD2.G、psPAX2及GFP载体菌种并用试剂盒提取这三种质粒;将pMD2.G、psPAX2及GFP载体质粒与转染试剂按比例混合后转染293T细胞生产病毒;收集病毒上清液并用超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒;将接种的293T细胞分为3组,并向每组接种有293T细胞的培养液中加入2、4、8、16 μl三种方法浓缩的病毒浓缩液,48 h后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测三种方法浓缩慢病毒后转染293T细胞的GFP表达情况。结果 荧光显微镜观察结果显示随着转染量的增加,GFP表达率增加,超滤管法浓缩病毒转染293T细胞后GFP的表达效率最高;流式检测显示病毒浓缩液法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(2.4±0.1)%、(3.8±0.3)%、(8.2±0.6)%、(12.2±0.3)%;超滤管法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(5.4±0.3)%、(7.4±0.4)%、(12.7±0.1)%、(17.3±0.6)%;超速离心法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(0.7±0.1)%、(1.2±0.1)%、(2.1±0.1)%、(0.4±0.2)%。超滤管法组与其他两组比较,P<0.05,差异有统计学意义。结论 不同方法浓缩慢病毒后的GFP转染效率不同,三种慢病毒浓缩方法中超滤管法浓缩慢病毒后的GFP转染效率最高。     

基于“绿色设计”理念的中药制药膜分离工艺选择原则与方法

面向绿色制造的中药制药工艺路线设计,亦称"绿色设计",其目的是极小化产品全生命周期过程的资源消耗和环境影响,协调优化经济效益和环境效益。以膜技术为核心的制药分离工艺技术与药物绿色制造息息相关,"环境、性能和成本"三大要求和成熟度、分离技术原理是制药分离工艺绿色设计的基本要素,"清洁工艺"可降低原料及能源耗损,切合"预防优于治理"的理念,也可提高企业的经济效益,对生态保护和经济建设的和谐发展具有重要保障作用。以构建膜与树脂技术系统集成为例,介绍中药制药工艺绿色设计具体实施方案,对中药制药分离工艺设计的技术经济问题开展分析和讨论。     

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S. viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S. viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为：以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。     

LV-EGFP标记兔角膜基质细胞体外基质层移植的实验观察

目的:探讨兔角膜基质细胞(CSCs)体外移植兔角膜后的存活时间。方法:体外培养原代兔CSCs,并行细胞免疫组化鉴定,利用慢病毒载体(LV)携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染兔CSCs,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态及荧光强度,体外动物实验,随机分为2组,实验组行LV-EGFP标记的兔CSCs细胞悬液角膜基质注射,对照组等量生理盐水角膜基质注射,转染后1wk,1mo取材冰冻切片观察移植的CSCs荧光,石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态。结果:LV-EGFP转染兔CSCs在倒置荧光显微镜下24h后可见少量荧光,96h和110h荧光较强,转染后的CSCs与正常CSCs细胞形态无明显差异;转染后1wk,1mo实验组中角膜基质层中可见绿色荧光,对照组中无绿色荧光;石蜡切片1wk实验组见明显上皮细胞增生及角膜轻微水肿,少量炎症细胞浸润,转染后1mo实验组上皮细胞增生减弱,未见角膜层水肿;对照组1wk,1mo均未见明显异常。结论:LV-EGFP标记的兔CSCs行体外角膜基质移植,可在角膜中至少存活1mo,且与邻近组织相容性较好。     

超声辐照参数对体外基因转染效果的影响

目的探讨超声辐照参数对体外基因转染效果的影响及最佳转染条件。方法将293T细胞种植于24孔板内,24h后更换为转染液进行超声辐照,EGFP质粒浓度为1mg/ml,每孔加入15μg;超声强度分为1.5、2.0、2.5W/cm2,辐照时间分为30、45、60s,微泡浓度分为20%、30%、40%;每个参数相互组合并重复4次。转染后72h于荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的表达,以流式细胞仪检测荧光细胞比例,CCK-8检测细胞存活率,计算转染效率。结果超声声强、辐照时间、微泡浓度均对转染效率有显著影响。辐照条件为2.0 W/cm2、辐照时间45s、微泡浓30%时转染效率最高,可达(35.25±1.40)%。结论超声辐照参数共同影响转染效果,低条件下相互协同,高条件下相互抑制,选择合适的辐照参数是超声介导体外基因转染的重要因素。     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

绿色木霉生产β-葡聚糖酶的产酶条件的优化

目的 研究和探讨绿色木霉固体培养和液体培养产酶的最佳条件。方法 利用绿色木霉高产β-葡聚糖酶的特性。结果 1固体培养的最佳条件为:培养温度29℃,氮源为(NH4)2HPO4;碳源采用麸皮:秸秆=3:2,培养时间为150 h,培养p H值为7.0;2液体培养的最佳条件为:培养温度为29℃,氮源为(NH4)2SO4,碳源为麸皮,培养时间为135 h,培养p H值为5.5。结论 获得了绿色木霉产β-葡聚糖酶的最佳培养条件,可为β-葡聚糖酶大规模生产提供重要基础。     

载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发央RNA(shRNA)表达载体，作用于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBV S基因融合表达载体，观察shRNA对融合蛋白的抑制作用，筛选出有效靶位。方法 利用pAVU6 27质粒，设计并掏建4个shRNA表达载体，与融合表达载体共转染AD293细胞，荧光显做镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时，逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。结果 成功掏建shRNA表达载体和HBs-EGFP融合表达载体；4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达，其中以579位点最有效，荧光表达抑制率为69．8％，RNA水平抑制率为74．6％。结论 筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。