低氧条件对小鼠ADSCs膜片形成及其生物学特性的影响

目的:观察低氧条件对小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)膜片生物学性能的影响.方法:分离培养C57/BL小鼠ADSCs并用Vit C法构建细胞膜片;氯化钴(CoCl2)模拟体内低氧环境,qPCR和Western Blot检测HIF-1α表达;组织学染色、透射电镜观察膜片形成;qPCR检测ADSCs干性及膜片分泌功能相关基因的表达.结果:成功构建ADSCs膜片;HIF-1α的表达随CoCl2浓度的升高而升高;低氧条件下,形成细胞膜片较薄,但膜片内细胞连接更紧密;低氧环境可增强ADSCs干性,促使ADSCs膜片合成更多黏附分子、分泌更多保护性生长因子.结论:低氧条件更利于ADSCs膜片构建、存活和生物学功能维持.     

CoCl2诱导黑素瘤A375细胞上皮间质转化、糖酵解及SB-431542干预研究

目的探讨CoCl2刺激的黑素瘤A375细胞上皮间质转化和糖酵解的作用机制及SB-431542对此的干预作用。方法选用本团队前期已证实的安全有效浓度的CoCl2（50～150μmol/L）刺激黑素瘤A375细胞,建立体外低氧模型,Western Blot检测HIF-1α、Nodal、上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin、MMP2及糖酵解各组分蛋白LDH-A、LDH-B的表达,以明确CoCl2对A375细胞上皮间质转化和糖酵解的影响作用。随后研究SB-431542对Nodal-ALK4-ALK7介导A375细胞上皮间质转化和糖酵解反应的抑制作用:本部分拟筛选安全有效浓度的Nodal受体抑制剂（SB-431542）分别作用于CoCl2介导的低氧模型,通过MTT实验确定SB-431542的安全浓度用于后续实验。Western blot检测SB-431542对CoCl2诱导细胞上皮间质转化和LDH活化相关蛋白的影响;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱的变化情况;此外,使用Western blot检测Nodal及其受体（ALK4、ALK7）的表达。结果 CoCl2可显著上调细胞上皮间质转化相关蛋白Vimentin、MMP2和促瘤相关蛋白Nodal及其受体（ALK4、ALK7）的表达,且表达与作用浓度成正相关; CoCl2能促进糖酵解活化相关蛋白表达,其中LDH-A表达上调,LDH-B的表达受到抑制（P<0.05）。MTT结果显示10μmol/L SB-431542处理48 h对细胞的增殖影响最小（P<0.05）; SB-431542可抑制Vimentin、MMP2和Nodal及其受体ALK4、ALK7表达（P<0.05）;促进糖酵解途径的相关蛋白LDH-A的表达下调（P<0.05）,抑制糖酵解途径相关蛋白LDH-B的表达上调（P<0.05）。结论CoCl2可诱导黑素瘤细胞上皮间质转化及糖酵解。SB-431542可通过抑制CoCl2诱导的Nodal-ALK4-ALK7信号通路抑制与上皮间质转化及糖酵解相关分子的表达。     

二氯化钴对缺血再灌注损伤保护作用的研究进展

缺血再灌注损伤是导致临床移植后脏器失活的重要原因之一。因此,如何减轻缺血再灌注损伤在移植外科有着极其重要的意义。二氯化钴(CoCl2)是一种小分子的晶体化合     

活性氧不参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖

目的 探讨活性氧是否参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)过度增殖.方法 用化学性缺氧模拟剂二氯化钴处理HPASMC,建立缺氧性肺动脉高压血管重塑的细胞模型 用外源性活性氧供体过氧化氢处理HPASMC,观察活性氧对细胞增殖的影响;活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理HPASMC,观察其对二氯化钴或过氧化氢诱导的细胞增殖的改善作用;应用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖,Western blot检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达,双氯荧光素染色和荧光照相术检测细胞内活性氧的含量.结果 在25 ～ 50μmol/L浓度范围内,二氯化钴处理24 h可诱导HPASMC增殖,50 μmol/L二氯化钴处理24 h可使细胞内HIF-1α的水平明显增加;与二氯化钴的作用类似,过氧化氢在12 ～ 25μmol/L浓度范围内处理24 h也可引起细胞增殖,但不改变HIF-1α的水平;在二氯化钴或过氧化氢处理前,用不同浓度的NAC预处理,在1 500 μmol/L浓度时,NAC预处理可明显抑制过氧化氢诱导的HPASMC过度增殖(P＜0.05),而对二氯化钴诱导的细胞增殖则无明显影响(P＞0.05);另外,50 μmol/L二氯化钴处理6～24 h对细胞内活性氧的含量无明显影响(P＞0.05).结论 化学性缺氧可诱导HPASMC过度增殖,其机制可能不依赖于活性氧.     

活性氧激活的ERK1/2通路在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用

目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测凋亡细胞百分比;Western blot法测定caspase-3、ERK1/2和p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol.L-1处理PC12细胞60 min可使磷酸化(p)ERK1/2的表达明显升高;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用500μmol.L-1N-乙酰半胱氨酸(NAC,为活性氧的清除剂)预处理1 h可抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用10μmol.L-1U0126(ERK1/2抑制剂)预处理2 h可保护PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目和cleaved caspase-3表达及线粒体膜电位(MMP)丢失均减少;10μmol.L-1U0126预处理还能抑制CoCl2对p-p38MAPK表达的上调作用。此外,应用20μmol.L-1SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理能抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用。结论活性氧激活的ERK1/2通路介导CoCl2对PC12细胞的损伤作用,并与p38MAPK通路存在相互的的激活作用。     

骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响北大核心

背景:细胞在缺氧条件下会发生功能的变化,而间充质干细胞分泌的外泌体可以缓解细胞缺氧带来的病理性损伤。目的:探讨不同浓度氯化钴对成肌细胞功能变化的影响,并进一步研究骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧凋亡和活性氧产生的作用。方法:体外分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过超速离心法提取外泌体,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot对外泌体进行鉴定。应用0,50,100,200μmol/L氯化钴干预C2C12成肌细胞1,3,5,7 d,CCK-8检测成肌细胞增殖活性变化;干预5 d,qRT-PCR检测成肌分化基因MyHC、MyoD、MyoG的表达水平,改良吉姆萨染色观察成肌细胞融合情况;干预3,5 d,流式细胞仪检测细胞凋亡率;干预3 d,使用DCFH-DA染色观察细胞活性氧水平。成肌细胞分为4组:对照组(0μmol/L氯化钴),氯化钴组(200μmol/L氯化钴),外泌体组(200μmol/L氯化钴+50 mg/L外泌体),NAC组(200μmol/L氯化钴+2 mmol/L抗氧化剂NAC)处理,干预3 d,检测凋亡率和活性氧水平。结果与结论:①外泌体呈杯口状结构,粒径分布在30-150 nm之间,CD9、TSG101表达阳性;②氯化钴对成肌细胞的增殖、分化有显著抑制作用(P<0.05),并且促进了细胞凋亡(P<0.05),高浓度的氯化钴对成肌细胞的功能抑制作用更加明显;③外泌体能够降低200μmol/L氯化钴所诱导的成肌细胞缺氧凋亡和活性氧水平(P<0.05),并与抗活性氧试剂NAC具有相似的作用(P<0.05);④结果表明,氯化钴对成肌细胞的生理功能抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性,而骨髓间充质干细胞来源外泌体与NAC具有相似的抗缺氧凋亡和降低活性氧产生的作用,其机制可能为外泌体通过降低活性氧产生的途径而缓解了成肌细胞的缺氧凋亡。     

氯化钴诱导缺氧环境对肝癌MHCC97-H细胞的影响

目的:探讨CoCl_(2)诱导缺氧环境对肝癌MHCC97-H细胞产生的影响,研究CoCl_(2)处理下MHCC97-H细胞中相关蛋白质表达水平变化及细胞活力和细胞凋亡情况。方法:分别在对照组(21%O_(2))和实验组(20μmol/L CoCl_(2))处理下培养MHCC97-H细胞,用Western-blot法检测细胞中蛋白质表达(HIF2α、G9a、Reptin),于0h、6h、24h、48h、72h用CCK8法检测细胞增殖,于6h、24h时用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与对照组相比,CoCl_(2)处理的MHCC97-H细胞中HIF2α、G9a、Reptin蛋白质表达显著升高(P<0.05),细胞活力降低,72h细胞活力显著低于对照组(P<0.05),24h后细胞凋亡显著增加(P<0.05)。结论:CoCl_(2)处理可对肝癌MHCC97-H细胞产生明显影响,20μmol/L CoCl_(2)即可导致细胞内相关蛋白质表达水平显著变化,影响细胞的活力和凋亡。     

硫化氢通过抑制iNOS-NO通路对抗化学性缺氧引起的PC12细胞损伤

【目的】 探讨硫化氢（H2S）是否通过抑制iNOS-NO通路对抗化学性缺氧诱导的PC12细胞损伤。【方法】应用化学性低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学改变;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;Griess试剂盒检测细胞培养液中的亚硝酸盐（NO的代谢物）的浓度;Western blot法检测iNOS蛋白的表达水平。【结果】 应用600µmol/L CoCl2处理PC12细胞24h可使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达明显增多;在应用600µmol/L CoCl2处理PC12细胞前30min,应用400µmol/LNaHS（H2S的供体）预处理细胞不仅可明显地抑制CoCl2诱导的iNOS表达及NO生成的增多,还能保护PC12细胞对抗600µmol/L CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目减少;在CoCl2损伤PC12细胞前60min应用iNOS抑制剂L-Canavanine(10µmol/L)预处理也能产生类似NaHS的作用。SB203580(p38MAPK特异性抑制剂)预处理60min也可以下调CoCl2引起的iNOS高表达。【结论】 iNOS-NO通路介导CoCl2引起PC12细胞的损伤作用; H2S通过抑制iNOS-NO通路对抗化学性缺氧诱导的PC12细胞损伤。     

缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞

背景：糖尿病下肢血管病变发病率的升高,使如何通过改善下肢血管及增加新生血管生成成为关注的焦点,临床上已用人脐带间充质干细胞局部肌肉注射进行治疗,但是具体的治疗效果及机制尚不明确。 目的：探讨缺氧预处理及氯化钴培养液对脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞的影响。 方法：分离、培养脐带间充质干细胞,经不同浓度氯化钴模拟体内病理状态下的缺氧,通过ELISA检测细胞上清中碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平表达、MTT检测细胞增殖,选取最适氯化钴浓度,染色体进行氯化钴诱导前后安全性检测,用含10 µg/L血管内皮生长因子、10 µg/L的碱性成纤维细胞生长因子及体积分数10%胎牛血清的DMEM-LG/F12培养液向内皮样细胞方向诱导分化,鉴定诱导前及诱导后内皮样细胞表型CD31、假性血友病因子,通过三维血管形成模型的观察进行诱导前后脐带间充质干细血管形成能力检测。 结果与结论：分离的脐带间充质干细经流式鉴定高表达脐带间充质干细相关表面标志。经含不同浓度氯化钴的培养液处理后,细胞增殖与作用时间呈正相关。根据碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平的表达,验证得出氯化钴浓度为200 µmol/L为最适浓度。染色体检测显示氯化钴干预后的安全性可靠。诱导后CD31及假性血友病因子强阳性表达,三维血管成形观察显示脐带间充质干细诱导后可形成直径大小不等的管腔样结构,证实脐带间充质干细可诱导为内皮样细胞,且具有成血管的能力。