大鼠玻璃体腔内注射氯化钴后视网膜的病理学观察

目的 给予大鼠玻璃体腔注射氯化钴溶液,观察其视网膜病理学变化.方法 将20只SD大鼠随机分为正常对照组、观察1周组、观察2周组、观察3周组,正常对照组不给予任何处理,正常饲养,其他各组给予左眼玻璃体腔注射4μl 3mmol/L的氯化钴,右眼注射4μl的0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为实验对照.分别于玻璃体腔注射后第1、2、3周末处死大鼠摘除眼球,利用常规病理切片HE染色及透射电镜观察视网膜组织损伤情况.结果 常规病理切片显示:玻璃体腔注射氯化钴的大鼠视网膜组织随着时间的延长,视网膜水肿,RGCs层变薄,RGCs细胞数量减少,细胞核皱缩,细胞排列紊乱;内、外核层细胞数量减少,细胞核皱缩;视锥、视杆细胞排列疏松、紊乱.透射电镜结果显示:视网膜内界膜水肿逐渐加重,外节膜盘结构逐渐紊乱,线粒体损伤严重.结论 大鼠玻璃体腔注射氯化钴可以造成视网膜组织的缺氧性损伤.     

氯化钴诱导低氧上调3T3-L1脂肪细胞单核细胞趋化蛋白1的表达

研究氯化钴体外模拟低氧对小鼠3T3-L1脂肪细胞单核细胞趋化蛋白1表达的影响.体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞分化程度和脂质积聚情况.氯化钴化学模拟脂肪细胞低氧环境,采用实时荧光定量PCR与蛋白免疫印迹法检测低氧诱导因子-1α的mRNA和蛋白水平;采用实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附法检测单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白水平,并对两者的蛋白水平进行相关性分析.氯化钴处理分化成熟的3T3-L1脂肪细胞后,低氧诱导因子-1α在mRNA及蛋白水平均显著上调;同时发现单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达水平和培养液中单核细胞趋化蛋白1蛋白的分泌水平均升高,且低氧诱导因子-1α与单核细胞趋化蛋白1蛋白水平呈现线性相关( r=0.864,P＜0.01).氯化钴诱导低氧上调3T3-L1脂肪细胞单核细胞趋化蛋白1的表达,参与脂肪组织慢性低度炎症的发生.     

高血糖对缺氧及非缺氧条件下培养的大鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达的影响及机制

目的 探讨血糖对缺氧状态及非缺氧状态下大鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的作用及机制. 方法 体外培养新生大鼠的心肌细胞,给予不同的处理因素培养6h,具体分组为:(1)正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖);(2)氯化钴(Cocl_2)模拟缺氧组(5.5mmol/L葡萄糖+400μmol/L Cocl_2);(3)高葡萄糖组(11.1、22.2、33.3 mmol/L葡萄糖);(4)Cocl_2(模拟缺氧)+高葡萄糖组(11.1mmol/L葡萄糖+400μmol/L Cocl_2,22.2mmol/L葡萄糖+400mmol/L Cocl_2>,33.3mmol/L葡萄糖+400μmol/Lcocl_2);(5)高葡萄糖+抗氧化剂α-tocopherol组(33.3mmol/L葡萄糖+100μmol/L α-tocopherol);(6) Cocl_2(模拟缺氧)+高葡萄糖+α-tocopherol组(33.3mmol/L葡萄糖+400μmol/L Cocl_2+100μmol/L α-tocopherol).观察高葡萄糖、Cocl_2、高葡萄糖合并氯化钴对HIF-1α mRNA及蛋白表达的影响,以及给予α-tocopherol阻断氧化作用后,高葡萄糖、高葡萄糖合并Cocl_2对HIF-1α mRNA及蛋白表达影响的变化.结果 (1)与正常对照组相比,Cocl_2模拟缺氧后,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达增加;(2)在非缺氧状态下,随着葡萄糖浓度(5.5、11.1、22.2、33.3mmol/L)的增加HIF-1α的表达逐渐增加;(3)Cocl_2合并高葡萄糖培养条件下,随着葡萄糖浓度(5.5、11.1、22.2、33.3mmol/L)的增加,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达逐渐减弱;(4)高葡萄糖合并α-tocopherol(33.3mmol/L Glu+100 μmol/L α-tocopherol)培养条件下,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达较单纯高葡萄糖(33.3mmol/L)时减弱;(5)Cocl_2合并高葡萄糖及α-tocopherol(33.3mmol/L Glu+400 μmol/L Cocl_2+100μmol/L α-tocopherol)的培养条件下,HIF-1α的表达较同样氯化钴合并高葡萄糖(33.3mmol/L Glu+400μmol/L Cocl_2)时增加. 结论 葡萄糖对非缺氧状态下培养的大鼠心肌细胞HIF-1α的作用是增强其表达,而对缺氧状态下培养的大鼠心肌细胞HIF-1α的作用是减弱其表达,其机制可能涉及活性氧(ROS)信号转导系统及氧化应激反应.     

2种人卵巢癌细胞乏氧耐药模型的比较研究

目的：采用二氯化钴（cobaltous chloride,CoCl2）化学诱导法构建人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3的乏氧耐药模型,并比较二者耐药特性。方法：（1）体外培养的A2780和SKOV3细胞分别加入不同浓度CoCl2培养液作用12、24、48、72 h,采用MTT法检测其增殖活性及对紫杉醇的耐药倍数;（2）采用150 μmol/L CoCl2培养液作用24 h构建乏氧环境,RT-PCR检测常氧和乏氧条件下乏氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF）1α mRNA的表达情况。结果：２种细胞的增殖抑制率与CoCl2呈剂量-时间依赖关系（A2780组：F=1 165.416,P＝0.000;SKOV3组：F=2 802.394,P＝0.000）。随着CoCl2浓度的增加,A2780和SKOV3细胞对紫杉醇的耐药倍数增加（F=7 842.711,P＝0.000）;在相同CoCl2浓度作用下,SKOV3细胞对紫杉醇的耐药倍数明显高于A2780（50 μmol/L组：t=-48.287,P＝0.000;100 μmol/L组：t=-263.205,P＝0.000;150 μmol/L组：t=-143.305,P＝0.000）。150 μmol/L CoCl2作用24 h,2种细胞耐药倍数分别为（9.84±0.11）和（21.08±0.08）,并出现稳定的HIF-1α mRNA表达,其中SKOV3细胞HIF-1α mRNA的表达增加量明显高于A2780细胞（t=-5.573,P＝0.000）。结论：CoCl2化学诱导法可成功建立卵巢癌细胞乏氧耐药模型,其耐药倍数与细胞类型有关。在相同条件下,SKOV3细胞株乏氧耐药模型较A2780更易建立,是乏氧耐药逆转研究较为理想的细胞株。     

氯化钴诱导低氧对3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白表达的影响

目的研究体外模拟低氧对小鼠3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白（ADPN）表达的影响。方法体外培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,将其诱导分化成为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞分化程度和脂质积聚情况。氯化钴（CoCl2）化学模拟脂肪细胞低氧环境,采用实时PCR（Real-TimePCR）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和ADPNmRNA的表达,蛋白质印迹法（Westernblotting）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达;酶联免疫吸附测定（ELISA）分析细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平。结果在CoCl,诱导3T3-L1脂肪细胞低氧的条件下,细胞内HIF-1αmRNA和蛋白的表达水平均显著上调;细胞内ADPNmRNA表达和细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平均显著下降;HIF-1αmRNA与ADPNmRNA的表达水平呈显著负相关（r=-0．854,P〈0．001）。结论CoCl2诱导低氧能够下调3T3-L1脂肪细胞ADPN的表达,该作用可能与脂肪细胞代谢功能障碍和胰岛素抵抗有关。     

The protection of dexmedetomidine against chemical hypoxia-induced neurons injury and its mechanism

目的 探讨α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是否通过抑制p38MAPK通路保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤.方法 应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞以建立化学性低氧损伤神经细胞模型.采用Western blot法测定p38MAPK蛋白的表达水平,CCK-8比色法检测细胞存活率,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡的形态学及数量改变,罗丹明123染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP).结果 在60～180 min 的时间范围内,600 μmol/L CoCl2处理PC12细胞后明显地促进磷酸化p38MAPK表达;在120 min,p38MAPK表达量达到高峰;400 μmol/L Dex不仅能保护PC12细胞对抗CoCl2引起的细胞毒性、致凋亡作用及MMP损伤作用,还能抑制CoCl2对p38MAPK表达的上调作用;p38MAPK抑制剂SB203580能模拟Dex的抗化学性低氧损伤的神经保护作用,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量减少及MMP升高.结论 Dex能保护神经细胞对抗化学性缺氧引起的损伤,抑制p38MAPK通路可能是其作用机制之一.     

氯化钴诱导低氧对大鼠骨折愈合的影响

目的 探讨氯化钴诱导低氧对大鼠骨折愈合的影响.方法 选用80只SD大鼠,制作左胫骨干骨折模型后随机分为对照组和实验组,实验组术后连续注射氯化钴(10 mg/kg、ip、qd)7d.骨折后7d、14d、28 d、42 d取材,拍X线片观察骨折愈合情况,采用Western blotting和免疫组织化学方法检测骨痂组织细胞低氧诱导因子(HIF-1 α)和成骨性标志物骨钙素(Osteocalcin,OC)的表达情况,分析氯化钴对骨折愈合的作用.结果 术后42dX线片显示实验组骨折基本愈合,对照组仍可见模糊的骨折线,14 d、28 d、42 d组的Lane-Sandhu X线评分均较对照组高(P＜ 0.05);免疫组化显示实验组骨折后7d的HIF-1 α阳性细胞百分率最高,后逐渐下降,但各时间组的百分率均高于对照组(P＜0.05);实验组中HIF-1α蛋白表达明显增多,其形成水平在骨折后第7天时最高,并持续高表达至第14天,以后逐渐下降;OC表达趋势与之一致.结论 在大鼠骨折模型中,氯化钴能显著提高HIF-1α在骨痂组织的含量,同时增加OC的表达,促进骨折愈合.     

尼氟灭酸对氯化钴诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用

目的：探讨尼氟灭酸（NFA）对氯化钴（CoCl2）诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用,阐明其可能的机制。方法将血管内皮细胞随机分为对照组、100μmol／L CoCl2损伤组和20、40μmol／L NFA保护组,四甲基偶氮唑蓝比色（ MTT）法检测各组细胞增殖活性,酶联免疫吸附试验（ ELISA ）检测细胞内相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax及Caspse-3的表达情况。结果 MTT检测,与对照组比较,100μmol／L CoCl2组在24 h细胞增殖活性明显降低（P＜0．01）;与CoCl2损伤组相比,20、40μmol／L NFA保护组在24 h细胞增殖活性升高（P＜0．05,P＜0．01）,40μmol／L NFA保护组更加明显。 ELISA法检测显示,与对照组比较,100μmol／L CoCl2组在24 h细胞Caspse-3、Bax的表达增多,Bcl-2表达减少（ P＜0．05,P＜0．01）。与损伤组相比,NFA处理缺氧后血管内皮细胞Caspse-3、Bax的表达减少,Bcl-2表达增多（P＜0．05,P＜0．01）。结论 CoCl2能诱导血管内皮细胞缺氧损伤,引起细胞的凋亡;NFA可以保护CoCl 2诱导的血管内皮细胞的缺氧损伤,这可能与上调Bcl-2、下调Bax和Caspse-3抑制其凋亡有关。     

右美托咪定对抗化学性低氧引起神经细胞的损伤及其机制

目的探讨α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是否通过抑制p38MAPK通路保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞以建立化学性低氧损伤神经细胞模型。采用Western blot法测定p38MAPK蛋白的表达水平,CCK-8比色法检测细胞存活率,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡的形态学及数量改变,罗丹明123染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP)。结果在60～180 min的时间范围内,600μmol/L CoCl2处理PC12细胞后明显地促进磷酸化p38MAPK表达;在120 min,p38MAPK表达量达到高峰;400μmol/L Dex不仅能保护PC12细胞对抗CoCl2引起的细胞毒性、致凋亡作用及MMP损伤作用,还能抑制CoCl2对p38MAPK表达的上调作用;p38MAPK抑制剂SB203580能模拟Dex的抗化学性低氧损伤的神经保护作用,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量减少及MMP升高。结论 Dex能保护神经细胞对抗化学性缺氧引起的损伤,抑制p38MAPK通路可能是其作用机制之一。     

缺氧环境通过HIF-1α/YAP信号促进大鼠生长板软骨细胞表型维持

目的 研究缺氧条件下缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）和Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）蛋白在软骨细胞表型维持中的作用。方法 生长板软骨细胞取自7日龄的SD大鼠,并通过氯化钴干预以模拟体外缺氧微环境。通过检测细胞外基质水平和Ⅱ型胶原（Collagen 2, Col2）蛋白水平表达变化来确定软骨细胞在氯化钴刺激下软骨表型变化。通过Western blotting方法检测HIF-1α、YAP蛋白水平在氯化钴刺激后的表达变化。结果 氯化钴于体外实验中模拟的缺氧环境能够促进软骨细胞细胞外基质的表达水平,并且能够上调Col2蛋白表达,同时上调HIF-1α和YAP蛋白水平的表达。抑制HIF-1α的表达可以下调缺氧环境所致的YAP蛋白表达水平的上调,而抑制YAP的表达并不能影响HIF-1α蛋白表达水平。结论 氯化钴于体外实验中模拟的缺氧环境可能通过HIF-1α/YAP信号促进大鼠生长板软骨细胞软骨表型的维持。