RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

目的：构建乙型肝炎病毒前C／C基因小发夹RNA（shRNA）表达载体，探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法：用基因重组技术构建shRNA表达载体，经酶切、测序鉴定后，与HBeAg表达载体pcDNA3．1-preC／C按7：1的比例，共转染HeLa细胞，采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验（MEIA）分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果：经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体；筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用，对mRNA的抑制率为75％，对蛋白质的抑制率为53％，其余两序列无明显抑制作用。结论：RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3．1-preC／C表达HBeAg。     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

dsRNA和RNA干扰技术

dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机的阐明使它有可能在基因敲除 ,基因功能测定等方面成为一项成熟的技术 ,这将在生命科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系 ,RNA干扰的机制和特点 ,RNA干扰技术的应用前景等作一综述     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响

目的探讨跨膜转运蛋白21（TMP21）对γ分泌酶活性的影响。 方法将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF（KO）]分为转染组（T）和对照组（C），转染组转染载有TMP21小分子干扰RNA（siRNA）的质粒，对照组转染空质粒。每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品（T1、C1），经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品（T2、C2），用γ分泌酶组分早老蛋白1（PS-1）特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品（IPT2、IPC2）。蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP21、PS-1和Nicastrin（NCT）蛋白表达量；应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β＆#61472;淀粉样肽42的生成总量。 结果蛋白质印迹法检测显示，TMP21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为（5294±247）ng/ml，在对照组样品IPC2中为（19110±579）ng/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.05）；各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化；TMP21可与PS-1共沉降。ELISA法检测显示，转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（348±18）pg/ml，对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（342±18）pg/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论TMP21可能为γ分泌酶的组分之一。在TMP21蛋白低表达状态下γ分泌酶活性升高，提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。     

siRNA抑制外源绿色荧光蛋白在neuro-2a细胞株中的表达

目的：用RNAi技术抑制哺乳动物神经元中外源报告基因的表达，并探讨该过程中RNAi的时间及剂量效应，为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供参考。方法：采用神经细胞来源的细胞系neuro-2a小鼠神经瘤细胞为模型，将外源绿色荧光蛋白（GFP）基因转染到neuro-2a细胞内，利用体外转录法合成siRNA，分为3个剂量组对其进行干扰。结果：Neuro-2a细胞可以被有效地转染，而且siRNA在neuro-2a细胞内可以有效发挥干扰作用。这种干扰作用呈现出一定的剂量效应。结论：RNAi技术可以成功用于neuro-2a细胞抑制基因的表达，这种对GFP表达规律及RNAi剂量效应的研究为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供了一定的理论参考和依据。     

耐核糖核酸酶内含HCV RNA病毒样颗粒的表达

目的 构建可以表达耐核糖核酸酶(RNase)的内含HCV RNA病毒样颗粒的载体质粒。方法 将表达载体pI NCCL用Hind Ⅲ酶切后，与用相同内切酶酶切的HCV RNA非编码区(5′-UTR)扩增产物，在T4 DNA连接酶的存在下连接，构建一新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR，再转化BL21-DE3 E．coli进行原核表达。结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL-HCV RNA5′-UTR，经原核表达为耐RNase的内含HCV RNA病毒样颗粒。结论 得到的pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR表达载体及原核表达系统，可作为一个耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台。