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91.
目的:构建乙型肝炎病毒前C/C基因小发夹RNA(shRNA)表达载体,探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法:用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切、测序鉴定后,与HBeAg表达载体pcDNA3.1-preC/C按7:1的比例,共转染HeLa细胞,采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验(MEIA)分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果:经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体;筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用,对mRNA的抑制率为75%,对蛋白质的抑制率为53%,其余两序列无明显抑制作用。结论:RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3.1-preC/C表达HBeAg。 相似文献
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目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。
结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后,pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26 ± 1.07)ng/ml 、(0.13 ± 0.05)Ncu/ml和(3.01 ± 0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50 ± 1.39)ng/ml、(1.12 ± 0.11)Ncu/ml和(12.33 ± 1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P < 0.05);pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达(t = 0.18,P = 0.86)。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。 相似文献
96.
dsRNA和RNA干扰技术 总被引:2,自引:0,他引:2
dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机的阐明使它有可能在基因敲除 ,基因功能测定等方面成为一项成熟的技术 ,这将在生命科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系 ,RNA干扰的机制和特点 ,RNA干扰技术的应用前景等作一综述 相似文献
97.
目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1(endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。 相似文献
98.
目的探讨跨膜转运蛋白21(TMP21)对γ分泌酶活性的影响。
方法将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF(KO)]分为转染组(T)和对照组(C),转染组转染载有TMP21小分子干扰RNA(siRNA)的质粒,对照组转染空质粒。每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品(T1、C1),经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品(T2、C2),用γ分泌酶组分早老蛋白1(PS-1)特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品(IPT2、IPC2)。蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP21、PS-1和Nicastrin(NCT)蛋白表达量;应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β&#61472;淀粉样肽42的生成总量。
结果蛋白质印迹法检测显示,TMP21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为(5294±247)ng/ml,在对照组样品IPC2中为(19110±579)ng/ml,组间差异有统计学意义(P〈0.05);各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化;TMP21可与PS-1共沉降。ELISA法检测显示,转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为(348±18)pg/ml,对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为(342±18)pg/ml,组间差异有统计学意义(P〈0.01)。
结论TMP21可能为γ分泌酶的组分之一。在TMP21蛋白低表达状态下γ分泌酶活性升高,提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。 相似文献
99.
目的:用RNAi技术抑制哺乳动物神经元中外源报告基因的表达,并探讨该过程中RNAi的时间及剂量效应,为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供参考。方法:采用神经细胞来源的细胞系neuro-2a小鼠神经瘤细胞为模型,将外源绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到neuro-2a细胞内,利用体外转录法合成siRNA,分为3个剂量组对其进行干扰。结果:Neuro-2a细胞可以被有效地转染,而且siRNA在neuro-2a细胞内可以有效发挥干扰作用。这种干扰作用呈现出一定的剂量效应。结论:RNAi技术可以成功用于neuro-2a细胞抑制基因的表达,这种对GFP表达规律及RNAi剂量效应的研究为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供了一定的理论参考和依据。 相似文献
100.
耐核糖核酸酶内含HCV RNA病毒样颗粒的表达 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 构建可以表达耐核糖核酸酶(RNase)的内含HCV RNA病毒样颗粒的载体质粒。方法 将表达载体pI NCCL用Hind Ⅲ酶切后,与用相同内切酶酶切的HCV RNA非编码区(5′-UTR)扩增产物,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR,再转化BL21-DE3 E.coli进行原核表达。结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL-HCV RNA5′-UTR,经原核表达为耐RNase的内含HCV RNA病毒样颗粒。结论 得到的pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台。 相似文献