衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低

背景：DNA损伤及损伤后的应答异常会导致基因组不稳定,基因组不稳定是肿瘤形成的重要因素之一。在细胞衰老过程中,衰老细胞基因组稳定性下降,对于端粒、端粒酶的研究以及对于原癌基因和抑癌基因的研究,表明细胞衰老和肿瘤有密切的联系。 目的：以氧化损伤为模型,探索DNA损伤应答异常是衰老细胞基因组不稳定性的直接原因。 方法：培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术进行检测鉴定。衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况,BrdU掺入实验检测细胞增殖情况。建立体外培养人间充质干细胞衰老模型,通过CCK-8法检测细胞存活情况, DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧,单细胞凝胶电泳观察细胞DNA损伤情况。 结果与结论：人间充质干细胞经长期培养发生衰老,培养40代以后,衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多,BrdU掺入能力显著下降,提示间充质干细胞长期培养后发生衰老。生存曲线结果显示H₂O₂作用下,年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞;活性氧及单细胞凝胶电泳结果显示,H₂O₂处理后衰老间充质干细胞DNA损伤更严重,修复时间更长,说明衰老间充质干细胞比年轻间充质干细胞对H₂O₂损伤更为敏感。     

内皮祖细胞移植对肺损伤炎症状态的影响

背景：内皮祖细胞在维持内皮系统功能及血管损伤后的修复中起重要作用,已广泛应用到心血管、下肢缺血、血管修复等多种疾病,但在炎症疾病及肺损伤中的研究较少。 目的：观察内皮祖细胞移植对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征肿瘤坏死因子α及白细胞介素10的影响,探讨细胞移植能否改善急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的炎症状态。 方法：同遗传背景SD大鼠30只随机均分为正常对照组、肺损伤组、细胞移植组。采用密度梯度离心法分离、培养SD大鼠的骨髓内皮祖细胞。肺损伤组、细胞移植组大鼠经尾静脉注射脂多糖建立急性肺损伤模型;正常对照组仅给予等量的磷酸盐缓冲溶液。造模半小时后,正常对照组、细胞移植组大鼠经尾静脉注入内皮祖细胞悬液;肺损伤组大鼠同法注入等量的磷酸盐缓冲溶液。 结果与结论：与肺损伤组相比,细胞移植组中白细胞介素10的水平显著增加(P < 0.001),肿瘤坏死因子α的表达下调,但差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植促进白细胞介素10的表达,下调肿瘤坏死因子α的表达,能改善损伤肺组织的炎症状态。     

移植肾活检：病理及组织学的早期诊断价值

背景：移植肾活检病理学组织学早期诊断意义重大,单中心回顾性研究临床诊断与治疗较少。 目的：通过对肾功能不全移植肾进行常规穿刺病理活检,根据病理诊断采取相应临床治疗方式,观察治疗效果,同时明确移植肾穿刺病理活检的安全性以及在临床诊治中的意义及其重要性。 方法：选取解放军第309医院器官移植中心202例肾移植患者为研究对象,其中80例为肾移植后移植肾功能延迟恢复,122例肌酐不明原因升高。在B超引导下应用活检穿刺针行移植肾穿刺活检,对活检组织标本予以相应染色和病理组织学观察,并进行相应的临床治疗。 结果与结论：穿刺组织中,除3例(1.5%)由于组织少难以诊断,其余病理诊断移植肾正常12例(5.9%),缺血再灌注损伤合并(或)急性肾小管坏死28例(13.9%),轻度钙调磷酸酶抑制剂类免疫抑制剂急性毒性损伤22例(10.9%),轻度钙调磷酸酶抑制剂类免疫抑制剂慢性毒性损伤12例(5.9%),超急性排斥反应1例(0.5%),疑为急性排斥反应29例(14.4%),急性T细胞性排斥反应34例(16.8%),急性抗体介导性排斥反应19例(9.4%),慢性T细胞介导排斥反应16例(7.9%),慢性T细胞介导排斥反应伴急性T细胞介导性排斥反应12例(5.9%),慢性抗体介导性排斥反应3例(1.5%),高血压因素4例(2.0%),间质纤维化和肾小管萎缩,未发现特定致病因素所致病变2例(1.0%),缺血性坏死2例(1.0%),移植后肾病复发３例(1.5%),C4d免疫组化染色阳性23例(11.4%),未发现患者及移植肾的不良反应。     

诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA

背景：微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,miRNA参与调控基因表达,在促进前体细胞增殖与分化中发挥了重要的作用。miRNA是否可促进前体细胞向心肌细胞的分化则鲜见报道。 目的：验证转入特定miRNA(miRNA-1、miRNA-499)诱导新生小鼠心脏肌成纤维细胞转分化为心肌样细胞的可行性。 方法：体外培养新生小鼠心脏成纤维细胞,常氧培养传代至P2;37 ℃低氧(体积分数3%O2)培养48 h;免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞特异性标记物波形蛋白的表达,免疫荧光染色、流式细胞技术检测心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维细胞表型转化的标记物α-平滑肌激动蛋白的表达。实验分为4组：miRNA-1转染组、miRNA-499转染组、miRNA-1/miRNA-499共转染组及空白对照组,采用miRNA芯片检测心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中微小RNA的表达差异;real-time qPCR方法验证芯片检测结果。 结果与结论：心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1、miR-499后,心脏发育不同阶段特异性因子发生不同程度的表达变化,与空白对照组相比,其余3组GATA4、Tbx5、Mef-2c、α-MHC表达明显增高,Mesp1、Isl1表达均无显著变化。结果表明,特定miRNAs可诱导心脏肌成纤维细胞表达心肌细胞特异性性标志物,具备诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞直接转分化的潜力。     

缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞

背景：糖尿病下肢血管病变发病率的升高,使如何通过改善下肢血管及增加新生血管生成成为关注的焦点,临床上已用人脐带间充质干细胞局部肌肉注射进行治疗,但是具体的治疗效果及机制尚不明确。 目的：探讨缺氧预处理及氯化钴培养液对脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞的影响。 方法：分离、培养脐带间充质干细胞,经不同浓度氯化钴模拟体内病理状态下的缺氧,通过ELISA检测细胞上清中碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平表达、MTT检测细胞增殖,选取最适氯化钴浓度,染色体进行氯化钴诱导前后安全性检测,用含10 µg/L血管内皮生长因子、10 µg/L的碱性成纤维细胞生长因子及体积分数10%胎牛血清的DMEM-LG/F12培养液向内皮样细胞方向诱导分化,鉴定诱导前及诱导后内皮样细胞表型CD31、假性血友病因子,通过三维血管形成模型的观察进行诱导前后脐带间充质干细血管形成能力检测。 结果与结论：分离的脐带间充质干细经流式鉴定高表达脐带间充质干细相关表面标志。经含不同浓度氯化钴的培养液处理后,细胞增殖与作用时间呈正相关。根据碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平的表达,验证得出氯化钴浓度为200 µmol/L为最适浓度。染色体检测显示氯化钴干预后的安全性可靠。诱导后CD31及假性血友病因子强阳性表达,三维血管成形观察显示脐带间充质干细诱导后可形成直径大小不等的管腔样结构,证实脐带间充质干细可诱导为内皮样细胞,且具有成血管的能力。     

应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体

背景：建立人骨髓间充质干细胞与猴的嵌合体肝脏对研究干细胞体内增殖与分化具有重要意义。 目的：应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体动物模型。 方法：分离成人骨髓间充质干细胞,纯化并培养至6代,使细胞量大于5×108。转染绿色荧光蛋白基因标记后在B超引导下移植到妊娠10周的胎猴肝脏中,幼猴出生后1个月和3个月,穿刺取肝脏组织活检,切片后荧光显微镜观察带绿色荧光的人源细胞数量及分布,免疫组织化学染色法检测人白蛋白的表达。 结果与结论：荧光显微镜观察发现,幼猴出生后1个月及3个月均发现有人源骨髓间充质干细胞在肝脏内存活,并发生迁移,分布趋向于集中。免疫组织化学检测发现,幼猴出生后1个月及3个月肝脏内有表达人白蛋白的细胞存在,分布与带有绿色荧光的细胞较为一致。提示应用成人骨髓间充质干细胞在猴胚胎早期能够建立人-猴肝脏嵌合体,人源性骨髓间充质干细胞可在猴肝中分化成具有合成白蛋白功能的细胞。     

体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化

背景：脂肪干细胞作为组织工程中种子细胞的选择,可以诱导为内皮细胞从而有效解决材料血管化困难的难题。 目的：体外观察脂肪干细胞经诱导向内皮细胞转分化的可能性、以及在立体培养基上的血管形成情况。 方法：切取人皮下脂肪,用酶消化法分离和培养脂肪干细胞,将传至第3代或第4代的脂肪干细胞用内皮细胞诱导液、同时在Matrigel三维培养基内诱导培养,观察细胞生长情况及变化。对脂肪干细胞和诱导细胞行免疫组织化学检查CD31的表达。 结果与结论：免疫组织化学检测脂肪干细胞的CD31表达阴性,诱导细胞CD31可见阳性表达。在三维立体培养基内诱导的细胞24 h逐渐迁徙成团,伸出伪足,诱导1周细胞形成网格样交叉,2周形成较长血管,后血管增粗,并出现分叉,CD31阳性表达。因此,脂肪干细胞体外可以被诱导向内皮细胞表型转分化,并形成血管,提示脂肪干细胞可以作为促进组织工程移植物血管化的种子细胞的理想选择。     

联合应用生长因子促骨髓间充质干细胞向韧带样细胞分化

背景：利用生长因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化成韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白是构建组织工程化韧带的关键。生长因子碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1在细胞定向分化过程中都起着十分重要的作用。 目的：采用转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。 方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。采用10 μg/L转化生长因子β1和25 μg/L碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间质干细胞进行诱导分化,分为空白组、转化生长因子β1组、碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1+碱性成纤维细胞生长因子组。观察生长因子对骨髓间质干细胞生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比骨髓间质干细胞分泌胶原蛋白量。把转化生长因子β1+碱性成纤维细胞生长因子联合诱导的骨髓间质干细胞使用BrdU荧光染色标记,然后移植到脱细胞真皮基质上,观察细胞增殖分布情况,并与空白组对照。 结果与结论：转化生长因子β1+碱性成纤维细胞生长因子联合组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也较高。脱细胞真皮基质上,转化生长因子β1+碱性成纤维细胞生长因子组细胞增殖分布情况明显优于空白组。提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激兔骨髓间质干细胞,能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

腰椎间融合后路非对称与对称固定螺钉应力的有限元比较

背景：经椎间孔腰椎间融合非对称固定的生物力学稳定性研究,发现固定效果与双侧椎弓根螺钉接近,可满足临床应用所需生物力学要求。经关节突椎弓根螺钉参与经椎间孔腰椎间融合非对称固定的螺钉力学安全性又会怎样呢？ 目的：建立L₄-₅功能节段左侧经椎间孔腰椎间融合后,分别予以同侧椎弓根螺钉+对侧经关节突椎弓根螺钉、同侧椎弓根螺钉+对侧经椎板关节突螺钉及双侧椎弓根螺钉固定的三维有限元模型,施加相同的载荷,分析不同运动状态下螺钉应力分布特点,比较3种螺钉应力状况。 方法：对一成人正常L₄-₅椎节段标本、椎间融合器、椎弓根螺钉和皮质骨螺钉进行64排螺旋CT 扫描,通过Mimics11.1建立左侧经椎间孔腰椎间融合后3种内固定组合(同侧椎弓根螺钉+ 对侧经椎板关节突螺钉、同侧椎弓根螺钉+对侧经关节突椎弓根螺钉及双侧椎弓根螺钉固定)的几何模型,利用Simpleware3.1软件分别建立三维有限元模型,模拟500 N\6 Nm载荷下前屈、后伸、左\右侧弯、左\右侧旋等6种运动状态,用Abaqus6.8软件进行螺钉应力变化和分布特点分析。 结果与结论：由于经椎间孔腰椎间融合入路切除了左侧关节突,造成内植物应力分布不对称,对弹性模量大的内固定器械—椎弓根螺钉应力影响最大,尤其是在左旋运动时。在不对称组合内固定中,由于关节突关节螺钉的使用,使对侧椎弓根螺钉应力相应增加,以左旋运动时尤为明显,但关节突关节螺钉断裂的危险性增高不明显。提示为降低螺钉断裂的风险,经椎间孔腰椎间融合后路3种组合内固定均应严格限制旋转运动,尤其是关节突切除侧的旋转运动。     

脊柱腰段正常及骨质疏松三维有限元数字模型的建立

背景：建立逼真的有限元模型是对脊柱进行有限元力学分析的重要基础,关于骨质疏松有限元模型的报道尚少。 目的：建立脊柱腰段各主要结构及骨质疏松腰椎的有限元数字模型,为正常脊柱腰段及骨质疏松患者腰椎的有限元力学分析打下基础。 方法：对1名健康男性志愿者行脊柱腰段的螺旋CT扫描,将所得图像先在Mimics中进行分隔和重建,在Geomagic中进行优化,在Ansys中赋材质及网格划分,建立三维有限元数字模型。 结果与结论：建立了包括全部腰椎、椎间盘及主要韧带的正常腰椎及骨质疏松腰椎三维有限元数字模型。该模型外形逼真,几何相似性好,可以随意旋转,方便从多角度观察、采集三维信息,各主要结构材料属性接近实际,适合进行生物力学研究。提示利用CT数据及mimics、geomagic、Ansys软件可以建立脊柱腰段正常及骨质疏松有限元数字模型。