嘌呤霉素致足细胞损伤细胞模型的建立

目的:建立小鼠足细胞损伤的细胞模型,为进一步从细胞、分子水平研究足细胞的牛物学作用,以及足细胞特别是裂孔隔膜(slit diaphragm)分子在蛋白尿发生、发展中的分子机制提供稳定、可靠的足细胞损伤模型.方法:应用不同浓度的嘌呤霉素(15 ms/L、45 ms/L和75 ms/L)作用于足细胞,通过流式细胞仪检测作用24 h和48 h后足细胞的凋亡情况,以确定嘌呤霉索的作用浓度和时间,建立足细胞损伤的细胞模型;并以噻唑蓝(MTT)检测足细胞损伤后的活力,应用免疫荧光染色观察裂孔隔膜关键分子Nephrin、Podocin以及骨架蛋白F-actin在足细胞损伤中的分布来评价足细胞损伤.结果:45 mg/L嘌呤霉素作用48 h以及75 ms/L嘌呤霉素作用24 h或48 h,足细胞明显凋亡.结论:嘌呤霉素可以呈时间和剂量依赖件诱导小鼠足细胞凋亡,45 mg/L嘌呤霉素作用 48 h后诱导的足细胞损伤模型稳定、可靠,可应用于足细胞损伤的研究.     

全反式维甲酸对大鼠嘌呤霉素氨基核苷肾病蛋白尿的抑制作用

近年来,全反式维甲酸(全反式视黄酸,all-trans retinoic acid,ATRA)用于某些实验性增生性肾炎的治疗取得了良好的效果。引起了人们极大的兴趣。本文报告小剂量ATRA对大鼠非增生性嘌呤霉素氨基核苷肾病的改善作用。     

应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株

目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.     

嘌呤霉素对C2C12成肌细胞增殖的影响及瞬时转染浓度的筛选

目的 研究不同浓度嘌呤霉素对C2C12细胞的生长抑制情况,确定细胞转染的最佳药物筛选浓度.方法 对C2C12细胞进行不同浓度(0、0.5、1、2、4、8μg/ml)、不同时间(24、48、72、96h)嘌呤霉素的处理,将细胞分为阴性对照组、阳性对照组和5组不同浓度嘌呤霉素处理组.用流式细胞仪计数C2C12活细胞数目,倒...     

黄芪甲苷联合糖皮质激素治疗嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠的疗效及其机制

目的:观察黄芪甲苷（astragaloside IV,AS-IV）联合糖皮质激素干预治疗嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside,PAN）肾病大鼠的疗效,并探讨其相关机制。方法:40只150~180 g无特定病原体级健康雄性Wistar大鼠被随机分为对照组、模型组（PAN组）、黄芪甲苷干预组...     

雷马曲班对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响

目的:观察雷马曲班对嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导的小鼠足细胞凋亡的影响。方法:将条件永生性小鼠足细胞随机分为4组,对照组用RPMI-1640培养液培养,模型组用100 mg/m L PAN诱导足细胞损伤,实验组先用100μg/m L雷马曲班干预1 h,再加入100 mg/m L PAN作用足细胞,雷马曲班组用100μg/m L雷马曲班单独作用足细胞;分别在24、48 h时收集各组细胞,应用FITC-Annexin V/PI双染色法荧光显微镜观察足细胞的凋亡并定量分析,透射电镜观察足细胞损伤、凋亡及超微结构变化。结果:Annexin V/PI染色荧光定量检测结果显示,与对照组相比,模型组、实验组24、48 h的足细胞凋亡率均明显升高(P均<0.05),雷马曲班组足细胞凋亡率无明显变化(P均>0.05)。与模型组相比,实验组24 h足细胞凋亡率明显下降(P<0.05),48 h足细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。透射电镜结果显示,实验组24、48h足细胞损伤均较模型组明显减轻,凋亡形态的细胞减少。结论:雷马曲班能够降低PAN诱导的足细胞凋亡,减轻足细胞超微结构损伤。     

SRT1720对实验性肾病大鼠足细胞的保护作用

目的:探讨沉默信息调节因子2相关酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)激活剂SRT1720对嘌呤霉素氨基核苷肾病(puromycin aminonucleoside nephrosis,PAN)大鼠足细胞损伤的保护作用?方法:雄性SD大鼠一次性腹腔注射150 mg/kg嘌呤霉素氨基核苷建立PAN肾病大鼠模型,设正常对照组?模型组?SRT1720治疗组[模型组大鼠给予SRT1720 100 mg/(kg?d)灌胃]?Bradford法检测大鼠的24 h尿蛋白总量;应用透射电镜观察足细胞超微结构;实时定量RT-PCR?Western blot 检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin及Podocin的表达?结果:①与正常对照组相比,PAN注射后第3天,模型组大鼠尿蛋白的排泄量开始增加(P < 0.01),至第7天达最高峰,尿蛋白总量达259.73 mg/24 h;SRT1720治疗组在治疗3 d后尿蛋白明显降低(P < 0.01),第7天则降到52.47 mg/24 h;②模型组大鼠血清白蛋白显著降低[(22.14 ± 3.05)g/L]而胆固醇则显著升高[(7.03 ± 1.64)mmol/L],SRT1720治疗后显著提高模型组大鼠血清白蛋白水平[(35.48 ± 3.96)g/L]并降低胆固醇水平[(2.81 ± 0.41)mmol/L];③透射电镜结果显示模型组大鼠肾小球足细胞足突广泛融合?消失,SRT1720治疗显著减轻足细胞足突的融合;④与正常对照组相比,模型组大鼠肾组织中Nephrin和Podocin核酸和蛋白表达均显著降低,SRT1720治疗组肾组织中Nephrin和Podocin表达显著上调,能够恢复到正常组的85%~90%?结论:SRT1720能够降低PAN大鼠蛋白尿,改善低蛋白血症和高胆固醇血症,并明显减轻足细胞损伤?     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒K12基因诱导裸鼠体内肿瘤的形成

目的证实卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K12基因在体外可以转化小鼠成纤维细胞系NIH313细胞，体内可以诱导肿瘤的形成。方法采用PCR法构建含KSHV K12基因的重组反转录病毒表达质粒，将该质粒转染。NIH313细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞。采用软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验，分别证实K12基因体外转化细胞和体内致瘤特性。免疫组化(IHC)染色进一步评价转化细胞及其诱导的肿瘤组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Fas和FasL的表达水平。结果K12基因转化的NIH313细胞在软琼脂中可以形成集落、在裸鼠体内可以形成肿瘤；转化的细胞及其诱导的肿瘤组织中可观察到VEGF、Fas和FasL的表达，其中，Fas和FasL的表达较高。结论KSHV K12基S因具有体外转化细胞、体内诱导肿瘤形成的能力。     

甘西鼠尾草总酚酸提取物抗嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞氧化应激损伤

目的 研究甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)在体内和体外对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病大鼠足细胞以及PAN诱导小鼠足细胞氧化应激损伤的作用.方法 (1)建立PAN肾病大鼠动物模型,给予SPE和他克莫司干预,分别在第5、10、15、21天留取肾组织标本,WT1染色计数足细胞数目,免疫荧光观察8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)荧光强度.(2)体外采用PAN致足细胞损伤模型,PAN作用小鼠足细胞24 h,分别加入含SPE、丹酚酸B(SalB)、迷迭香酸(RA)及他克莫司的培养基培养6、12、24、48 h,观察足细胞骨架相关蛋白F-actin的表达,流式细胞仪分析细胞内活性氧(ROS)荧光强度.结果 (1)肾小球WT1细胞计数结果显示,PAN组第5天时足细胞数已开始下降,第15天达(14.4±0.7)个/肾小球切面,较正常组(37.2士1.5)个/肾小球切面减少(P＜0.05),SPE组与阳性对照组(他克莫司组)各时间点足细胞数量高于PAN组;第15天时,阳性对照组肾小球WT1细胞计数与SPE高剂量组较为接近(P＞0.05).第5天时PAN组大鼠肾组织8-OHdG荧光强度较正常组增强,第10天上升至高峰,而后开始减弱,第15天时仍高于正常组;给予药物干预后,大鼠肾组织的8-OHdG荧光强度降低,其中阳性对照组与SPE高剂量组8-OHdG荧光强度较为接近.(2)体外研究发现,PAN作用24 h后,F-actin几乎完全解聚,少数细胞尚有残存的被切断的丝状结构,给予SPE、SalB、RA及他克莫司治疗后,PAN诱导的足细胞损伤明显减弱,细胞内重新出现极性分布的微丝.与正常组相比,PAN作用小鼠足细胞24 h后ROS荧光强度增加(P＜0.05).给予药物干预后足细胞内ROS荧光强度降低,24 h SPE低剂量组、SalB高剂量组和RA高剂量组与阳性对照组足细胞内ROS的荧光强度降低程度相近(P＞0.05),24 h SalB降低足细胞内ROS荧光强度效果优于RA,且与药物剂量呈正相关.结论 本研究从体内及体外证实,SPE对PAN所致足细胞氧化应激损伤具有保护作用.     

嘌呤霉素肾病鼠尿蛋白量与足突形态改变的关系

目的 :研究嘌呤霉素肾病大鼠尿蛋白排出量与肾小球上皮细胞足突的形态变化之间的相互关系 ,初步探讨蛋白尿的发生机制。　 方法 :30只SD大鼠随机分为实验组和对照组 ,在 2天、5天、10天、15天、2 0天 5个不同时间点应用双缩脲法测定大鼠 2 4h尿蛋白排出量 ,并用透射电镜摄片 ,图像分析及形态计量学的方法 ,研究大鼠在不同时间点的足突形态变化 ,进而分析尿蛋白排出量与足突形态改变之间的相互关系。　 结果 :① 2 4h尿蛋白定量结果示 ,注药 5天后尿蛋白排出量逐渐增多 ,10天时尿蛋白排出量与对照组差异非常显著 (P <0 0 1) ,15天时尿蛋白排出量恢复 ,与 10天比差异亦非常显著 (P <0 0 1) ,且与对照组相比差异仍显著 (P <0 0 5 ) ,至 2 0天尿蛋白排出量与对照组无差别 (P >0 15 )。②注射嘌呤霉素后 ,足突形态呈现逐渐肿胀到融合以后又逐渐呈恢复的变化 ,其中 2～ 2 0天实验组足突宽度 ,体积密度 ,比表面与对照组相比差异有高度显著性 (P <0 0 1) ,表面积密度在2～ 15天与对照组差异显著 (P <0 0 5 ) ,各参数均于 10天达极值。③尿蛋白排出量与足突宽度正相关 (r =0 92 94,P =0 0 2 ) ,与体积密度成正相关 (r =0 95 5 9,P =0 0 11) ,而与比表面呈负相关 (r=- 0 9388,P =0 0 18)。　 结论 :尿