nephrin及WT-1在嘌呤霉素大鼠肾病模型足细胞中的表达及意义

目的应用嘌呤霉素氨基核苷（PAN）模型,研究足细胞相关蛋白nephrin和肿瘤蛋白-1（WT-1）在足细胞中的表达及在肾小球硬化进展过程中的意义。方法单次尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷制作PAN模型,在4、14及20周处死大鼠,取其肾脏,切片,nephrin及WT-1免疫组化染色,半定量分析后进行统计学分析。结果对照组免疫组化染色nephrin沿肾小球毛细血管襻呈较为均匀的黄褐色粗颗粒样的线状分布,4周时与对照组比较PAN组nephrin略有分布不均,部分区域染色减弱或消失（均值为10．23±1．256和8．23±0．88,P〈0．05）,14周时在有节段性硬化的区域nephrin无表达（均值为7．58±0．71和10．23±1．26,P〈0．05）,而在20周时硬化的区域基本无表达（均值为7．88．±0．92和6．08±1．34,P〉0．05）,与对照组比较均有明显减少。4周时WT-1在足细胞核表达,呈深棕黄色粗大颗粒,与对照组比较无统计学意义（均值为10．14±2．02和10．11±1．56,P〉0．05）;14周时PAN组WT-1表达较对照组有所减少（均值为9．02±1．73和6．8±1．89,P〈0．05）;20周时与对照组比较PAN组WT-1明显减少（均值为7．34±1．22和4．43±1．01,P〈0．05）,足细胞数量随着时间的延长依次递减。结论Nephrin的表达在肾小球硬化过程中进行性减少,甚至消失;WT-1的表达随着肾小球硬化的进展逐渐减少。Nephrin和W-1表达的降低均反映足细胞的结构破坏和数量的减少,因此两者表达可反映足细胞损伤和肾小球硬化的关系。     

MicroRNA-194过表达与抑制表达慢病毒载体的构建及对骨肉瘤细胞转染与筛选的方法学研究

目的：构建针对人microRNA—194过表达及抑制表达的慢病毒表达载体,寻找与探讨感染人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os的最佳步骤和方法。方法：利用PcR方法调取相应目的基因进行酶切,经电泳回收后与目的基因进行连接,产物转化细菌感受态细胞,对克隆进行PcR鉴定和测序对比分析后,构建相应microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体;在人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2—os转染及筛选过程中,根据不同阶段及浓度设定相应实验组,并设相应对照组。倒置显微镜观察转染效率,筛选情况,进行比较。结果：PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确。过表达及抑制表达重组慢病毒的滴度分别为15×10^8TU／ml及4×10^8TU／ml。感染复数（multiply of infection,MOI）值测定,实验组及对照组转染效率无明显差异,获得MOI值及感染时间数据。通过新的综合设计,经筛选后获得转染效率满意的目的克隆细胞。结论：成功构建了microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体,并通过新的综合考虑设计,对人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os进行转染和筛选后,可较快和较高效率获得满意目的细胞。     

不规则趋化蛋白在嘌呤霉素氨基核苷肾病模型中的表达

目的：检测CX3C族趋化因子不规则趋化蛋白(fractalkine,Fkn)在嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)肾病中的表达，进一步阐明肾病的发病机制，为肾病的治疗提供新的靶点。方法：从Wistar大鼠的颈静脉给予PAN，对照组给予等量生理盐水，在不同的时间点观察PAN引起的尿蛋白改变和肾脏炎性细胞浸润情况，并于第l、3、5、7、10天处死动物，制作肾组织匀浆和冰冻切片，分别用于RT-PCR和免疫组化研究，观察在：PAN注射的不同时间点肾组织中Fkn mRNA和蛋白质的表达情况；同时在体外用白介素-1β（IL-1β）刺激培养的肾小管上皮细胞观察Fkn的表达。结果：：PAN注射后第5天尿蛋白开始升高，持续增加直至第10天，同时伴有肾间质中CD4^ T细胞，CD8^ T细胞和单核／巨噬细胞的增加。RT-PCR和免疫组化均显示Fkn在第7、第10天表达升高，第3天主要分布在肾小球，以后主要在肾小管上皮细胞表达。用IL-1β刺激后1h体外培养的肾小管上皮细胞即开始表达FknmRNA，在4～6h达到高峰。结论：本文首次观察到Fkn在PAN肾病模型中表达增高，其特征为先出现于肾小球，后移行至肾小管，并早于肾组织中白细胞浸润及蛋白尿的发生。提示：Fkn可能是肾病发病和进展过程中的另一重要的相关分子。     

嘌呤霉素肾病大鼠肾小球足细胞相关分子表达的共定位分布

目的:研究嘌呤霉素肾病大鼠肾小球足细胞相关分子在病变过程中的表达与分布的关系及变化.方法:42只SD大鼠随机分为实验组和对照组,建立嘌呤霉素肾病模型,并在24h、24h、2天、5天、10天、15天、20天七个不同的时间点,应用免疫荧光双标记的方法,通过激光共聚焦显微镜对足细胞相关分子nephrin、podocin,α-actinin-4以及CD2AP两两之间的分布关系及变化进行研究.结果:正常大鼠肾小球中CD2AP与nephrin及podocin的染色沿肾小球血管襻有部分重叠,而两者的分布模式略有不同,但这种共定位关系不随病变的发展而变化;CD2AP与α-actinin-4的分布也有部分重叠关系,且随着病变进展,其荧光重叠程度增加;α-actinin-4与nephrin及podocin在正常时有极小部分重叠,随着病程变化,两者的分布模式与分布量的变化均不同步.结论:足细胞相关分子nephrin、podocin及CD2AP之间以功能复合体的形式相互联系并参与蛋白尿的发生发展,而足细胞相关分子的分子行为可能在蛋白尿的发生中起重要作用.     

新生小鼠足细胞损伤对肾小球发育的影响

目的 探讨新生小鼠中足细胞损伤对肾小球发育的影响及其机制。 方法 于新生ICR小鼠出生后1 d注射嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PA)，并以注射生理盐水作为对照。观察出生后第2、4、8、12、30、60、90天时肾重/体重、尿蛋白、血压及组织学的改变。应用免疫组化及定量RT-PCR方法测定肾皮质内肾母细胞瘤基因(WT-1)、CD31、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1、血管生成素(angiopoietin，Ang-1、Ang-2)及其受体Tie-1、Tie-2的表达水平。 结果 注射PA后，新生小鼠肾重、体重均明显低于对照组。出生后第2天(注射PA后1 d)时，肾小球足细胞出现足突广泛融合和微绒毛的脱落；第12天时，肾小球内CD31的表达明显下降，部分肾小球萎缩、发育不良，肾皮质浅层小球成熟指数明显下降；第30天时，原先发育不良的肾小球逐渐被吸收；第60天时，剩余肾小球出现系膜区的扩张和小球节段性硬化。PA鼠在第30天时出现蛋白尿；第60天时血压显著增高。定量RT-PCR显示，第2天时肾皮质Ang-1表达明显上调，Flk-1及Tie-2明显下降。 结论 PA可以在早期损伤的新生ICR小鼠足细胞，改变VEGF、血管生成素系统的表达，导致肾小球毛细血管袢发育不良及在后期产生蛋白尿、高血压和肾小球硬化。     

大鼠嘌呤霉素氨基核苷肾炎模型的制作

以嘌呤霉素氨基核苷 (ｐｕｒｏｍｙｃｉｎａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ,ＰＡＮ)制作肾病的实验性大鼠模型已有四十多年的历史。因其发病时临床表现和病理变化过程与人类ＭＣＮＳ(Ｍｉｎｉｍａｌｃｈａｎｇｅｎｅ ｐｈｒｉｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍ)及ＦＧＳ(ｆｏｃａｌｇｌｏｍ     

柴苓汤可增强环孢菌素A对给予氨基核苷嘌呤霉素大鼠肾脏的保护作用

柴苓汤临床用于治疗肾病综合征及肾小球肾炎,本次对柴苓汤能否增强环孢菌素A(CyA)治疗肾病的疗效进行了探讨。 材料和方法:选用SD系雄性大鼠,单次静脉给予氨基核苷嘌呤霉素(PAN)100mg/kg制作肾病模型,对照组给予生理盐水。造模1d后即开始经口给予柴苓汤(1.0g/kg),造模6d后口服CyA(10、20、40mg/kg)。根据造模后6、11、15d尿蛋白排泄量及造模后15d血中总胆固醇、甘油三酯和白蛋白水平判断肾脏病变程度。     

健肾片对实验性肾病模型的抗氧化作用

在临床验证和初步实验的基础上,观察健肾片对实验性肾病模型的抗氧化作用。运用嘌呤霉素腹腔注射所致肾病综合征大鼠病理模型,使用化学发光法检测实验动物的血浆及红细胞的超氧阴离子含量。结果发现,病理组第3、4周血浆O_2~-为19.62±2.77kcpm,19.18±2.07kcpm;红细胞O_2~-为5.83±0.61kcpm,5.65±0.64kcpm;治疗组血浆O_2~-为12.41±1.82kcpm,13.39±1.67kcpm;红细胞O_2~-为4.79±0.65kcpm,4.69±0.51kcpm。证明健肾片可明显降低实验动物的血浆及红细胞超氧阴离子,具有较强的抗氧化作用,能够减轻肾脏病理变化。     

柴黄益肾方对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠尿蛋白及纤溶功能的影响

目的:探讨柴黄益肾方提取物(CYE)对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病大鼠尿蛋白及纤溶功能的影响.方法:大鼠经颈静脉一次性注射PAN 5mg/100g体重制备大鼠肾病模型,于造模后第二天开始灌胃给药,连续给药21周后检测24小时尿蛋白含量,腹主动脉取血测定TPA、PAI、AT-Ⅲ纤溶功能. 结果:21周给药蒙诺与CYE均能显著降低尿蛋白,升高组织型纤溶酶原激活物活性(TPA),降低纤溶酶原活化物抑制因子(PAI),增强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ) 活性.结论:柴黄益肾方提取物能抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的大鼠肾病模型的尿蛋白排泄,并能改善纤溶功能.     

嘌呤霉素致足细胞损伤细胞模型的建立

目的:建立小鼠足细胞损伤的细胞模型,为进一步从细胞、分子水平研究足细胞的牛物学作用,以及足细胞特别是裂孔隔膜(slit diaphragm)分子在蛋白尿发生、发展中的分子机制提供稳定、可靠的足细胞损伤模型.方法:应用不同浓度的嘌呤霉素(15 ms/L、45 ms/L和75 ms/L)作用于足细胞,通过流式细胞仪检测作用24 h和48 h后足细胞的凋亡情况,以确定嘌呤霉索的作用浓度和时间,建立足细胞损伤的细胞模型;并以噻唑蓝(MTT)检测足细胞损伤后的活力,应用免疫荧光染色观察裂孔隔膜关键分子Nephrin、Podocin以及骨架蛋白F-actin在足细胞损伤中的分布来评价足细胞损伤.结果:45 mg/L嘌呤霉素作用48 h以及75 ms/L嘌呤霉素作用24 h或48 h,足细胞明显凋亡.结论:嘌呤霉素可以呈时间和剂量依赖件诱导小鼠足细胞凋亡,45 mg/L嘌呤霉素作用 48 h后诱导的足细胞损伤模型稳定、可靠,可应用于足细胞损伤的研究.