嘌呤霉素肾病鼠足突形态改变的形态计量学研究

目的:定量研究嘌呤霉素肾病大鼠模型从建立到恢复过程中,足突的形态变化规律。方法:用透射电镜摄片,图像分析仪分析并应用形态计量学的方法,研究了33例大鼠(嘌呤霉素注射实验组及生理盐水注射对照组)不同时间点的足突形态变化。结果:注射嘌呤霉素后,足突表现出由变宽到融合又逐渐恢复的形态变化,形态计量学的结果进一步表明,各时间点实验组足突宽度,体积密度,比表面与对照组相比有高度显著性差异(P<0.01),表面积密度在2--15天与对照组差异显著(P<0.05)。且实验组内相邻的不同时间点间比较, 足突宽度、体积密度、表面积密度、 比表面差异均具有高度统计学意义(P<0.01)。结论:形态计量学对嘌呤霉素肾病足突形态研究,定量表现出足突由变宽到融合以后逐渐恢复的动态过程,为今后对功能与分子水平的研究提供早期准确的实验形态依据。     

雷公藤甲素对嘌呤霉素所致足细胞凋亡的抑制作用

目的 为了探讨雷公藤治疗足细胞病变的机制,利用嘌呤霉素诱导足细胞凋亡的体外损伤模型,观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用及其机制.方法 用CCK法观察雷公藤甲素对足细胞增殖活性的影响;应用TUNEL染色法定性观察雷公藤甲素对嘌呤霉素诱导的足细胞凋亡的保护作用;采用PI染色后再经流式细胞仪来定量分析雷公藤甲素对足细胞凋亡的抑制效应.结果 雷公藤甲素质量浓度小于1 μg/mL时对足细胞生存率没有明显影响;100 μg/mL嘌呤霉索诱导足细胞凋亡,但是此凋亡效应可以被1 μg/mL雷公藤甲素抑制;而且这种抑制作用具有时间依赖性.结论 雷公藤甲素通过抑制细胞凋亡来保护足细胞.雷公藤甲素对足细胞的保护作用可能是临床上雷公藤有效治疗足细胞病变的机制之一.     

免疫核糖核酸体外介导白细胞粘附抑制反应中转录和翻译的意义

以[~3H]Leu-LAI为指标,观察放线菌素D和嘌呤霉素对小鼠S_(180)腹水瘤细胞特异性iRNA体外转移细胞免疫活性的影响。结果表明,正常小鼠脾淋巴细胞经iRNA致敏后,用放线菌素D阻断其转录,或用嘌呤霉素阻断其翻译,并不能使该淋巴细胞失去对相应抗原产生LAI反应的能力;若先将淋巴细胞分别与放线菌素D或嘌呤霉素温育,使转录或翻译被阻断后再用iRNA作用时,见对相应抗原无LAI反应。这些结果说明iRNA体外介导LAI反应的过程,必须有受体细胞的转录或翻译功能参与;同时也提示临床使用iRNA治疗恶性肿瘤时,先行治疗方法若能抑制淋巴细胞的转录或翻译,则有可能降低iRNA的疗效,     

1,25(OH)2D3抑制嘌呤霉素氨基核苷酸肾病大鼠足细胞凋亡

目的 观察1，25（OH）2D3对嘌呤霉素氨基核苷酸（PAN）肾病大鼠足细胞凋亡的影响。 方法 72只雄性SD大鼠随机分为健康对照组（NC）、PAN组和1，25（OH）2D3治疗组 [1，25（OH）2D3 0.2 μg·kg-1·d-1灌胃]。一次性尾静脉注射PAN 100 mg/kg体质量建立足细胞损伤的PAN肾病动物模型。于3、7、14、21 d分批处死动物，分别检测不同时间点尿蛋白量（24 h）和肾功能。光镜和透射电镜观察肾组织学改变。TUNEL法检测足细胞凋亡。RT-PCR、免疫荧光、免疫组化分别检测nephrin、TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。Western印迹检测磷酸化（p）-Smad2/3的表达。 结果 （1）PAN组各时间点BUN、Scr、尿蛋白量（24 h）[7 d时，（20.26±4.87） mg比（1.01±0.41） mg，P < 0.01]均高于同期的NC组，而肾小球足细胞显著减少[14 d时，(10.9±4.2) 个/肾小球切面比(31.9±6.2)个/肾小球切面，P ＜ 0.01]，且足突增宽融合。1，25（OH）2D3治疗组各时间点尿蛋白量（24 h）[7 d时（9.95±3.82） mg]和BUN、Scr显著低于PAN组（P < 0.05），且肾脏病理改变减轻。（2）PAN组7 d时nephrin mRNA和蛋白的表达显著降低，nephrin由正常的沿毛细血管襻线状分布向颗粒状、团快状改变，足细胞凋亡数显著增加[14 d时，（37.4±7.9）个/肾小球切面]。与PAN组相比，1，25（OH）2D3治疗组各时间段nephrin mRNA和蛋白的表达显著增加，且保持着正常的沿毛细血管襻线状分布，足细胞凋亡数显著减少[14 d时，(21.9±6.2) 个/肾小球切面，P < 0.01]。（3）PAN组TGF-β1 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad2/3蛋白的表达均高于NC组（P < 0.01），1，25（OH）2D3治疗组TGF-β1 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad2/3蛋白的表达低于PAN组（P < 0.01）。 结论 1，25（OH）2D3能有效地抑制PAN诱导的足细胞凋亡，减少尿蛋白，其对足细胞损伤的保护作用可能与抑制TGF-β1信号通路有关。     

Rac1及Cdc42在肾上腺髓质肽(AM)缓解嘌呤霉素氨基核苷(PAN)所诱导足细胞损伤中作用机制的初步探讨

目的 观察肾上腺髓质肽（adrenomedullin,AM）对嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside,PAN）所诱导受损足细胞的作用以及Rac1/Cdc42表达变化,初步探讨其可能机制。方法 将小鼠肾足细胞株分为对照组、PAN处理组（100 μg/mL）、PAN联合AM处理组（10^-7 mol/L）及PAN联合AM和蛋白激酶A（PKA）抑制剂H89（10^-6 mol/L）处理组。经一次性腹腔注射PAN（150 mg/kg）建立大鼠足细胞损伤模型,每天经尾静脉注射AM蛋白（66 μg/kg）进行干预。SDS-PAGE法检测尿蛋白水平,电镜观察足细胞足突宽度变化,双重免疫荧光染色及/或Western blot观察足细胞特异性骨架蛋白（synaptopodin、nephrin）、Rac1及Cdc42的蛋白表达水平,实时定量PCR（qRT-PCR）检测synaptopodin、nephrin的mRNA表达,谷胱甘肽巯基转移酶-拉下实验（GST-pull down assay）法检测Rac1及Cdc42活性变化。结果 PAN在体内、外均显著降低synaptopodin、nephrin的蛋白或/及mRNA表达水平,且显著升高desmin表达;大鼠PAN肾病模型的尿蛋白水平显著升高,足突宽度显著增加;PAN显著降低Rac1、Cdc42总蛋白及活性水平。上述由PAN所介导的效应被AM显著抑制;H89显著阻断AM的体外作用。结论 AM主要通过PKA通路促进受损足细胞的修复,该保护机制与AM调控Rac1/Cdc42表达密切相关。     

温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L表达的影响

目的观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤的小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L(Cathepsin L,CatL)表达的影响。方法体外培养小鼠永生系足细胞,将其分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10%温阳活血利水方血清组(简称10%中药血清组)、20%中药血清组及中药血清空白对照组。正常对照组以培养液孵育足细胞24 h,模型组应用嘌呤霉素45 mg/L作用于足细胞24 h;在模型组干预基础上,地塞米松组加用地塞米松1μmol/L共孵育24 h;10%及20%中药血清组分别加用10%及20%的中药血清共孵育24h,并设中药血清空白对照组(单用中药血清孵育24 h)。采用细胞免疫荧光染色观察各组足细胞CatL及其底物Synaptopodin荧光表达改变;异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞纤维肌动蛋白(F-actin),并采用F-actin外周环评分(cortical F-actin score,CFS)半定量分析足细胞F-actin分布。结果与正常对照组比较,模型组足细胞Synaptopodin表达水平明显降低,CatL表达水平升高,F-actin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分明显升高(P0.01)。与模型组比较,地塞米松组、10%、20%中药血清组足细胞Synaptopodin蛋白表达升高,CatL表达水平降低,CFS评分亦降低(P0.05,P0.01)。与地塞米松组比较,10%中药血清组Synaptopodin表达降低(P0.05),20%中药血清组CFS评分明显降低(P0.05)。结论温阳活血利水方能上调嘌呤霉素损伤的足细胞Synaptopodin表达,下调CatL表达水平,减少骨架蛋白F-actin的重构,有助于稳定足细胞actin骨架,改善足细胞融合。     

嘌呤霉素氨基核苷对足细胞信号转导通路影响的研究进展

蛋白尿是原发性肾小球疾病的临床表现之一,引起蛋白尿产生的主要原因是肾小球滤过屏障的完整性受到破坏.而足细胞是肾小球滤过屏障的主要成分,维持着滤过膜的完整性,从各种因素导致的足细胞损伤将会破坏滤过膜的完整性,从而产生蛋白尿.     

甘草甜素及地塞米松干预嘌呤霉素诱导足细胞损伤的体外研究

目的 观察甘草甜素(GL)及地塞米松(DEX)对受损足细胞凋亡的影响,探讨其细胞学作用机制.方法 建立嘌呤霉素(PAN)致足细胞损伤模型,应用不同水平PAN(12.5mg?L-1“、25.0mg?L-1、50.0 mg?L-1、75.0 mg?L-1、100.0 mg?L-1)作用于足细胞,培养48 h后检测细胞凋亡率,选取合适的PAN作用质量浓度.将体外培养小鼠足细胞(MPC5)分为对照组、PAN组、DEX1组、DEX2组、DEX3组、GL1组、GL2组、GL3组,对照组加入等体积RPMI 1640培养液培养;PAN组加入PAN,终质量浓度50 mg?L-1;DEXL、2、3组同时加入PAN(终质量浓度50 mg?L-1)和DEX(终浓度分别为0.1μmol?L-1、1.0 μmol?L-1、10.0 mol?L-1);GL1、2、3组同时加入PAN(终质量浓度50.0 mg?L-1)和GL(终质量浓度分别为400 n1g?L-1、600 mg?L-1、800 mg?L-1),培养48 h.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果 50.0 nmg?L-1 PAN诱导足细胞凋亡较对照组明显升高(P＜0.05),75.0 mg?L-1、100.0 nmg?L-1PAN诱导足细胞凋亡率显著升高,大部分足细胞死亡(Pa＜0.01).DEX1组、2组足细胞凋亡率明显低于PAN组(Pa＜0.05),DEX 3组(10.0 μmol?L-1)干预后足细胞凋亡率显著低于PAN组(P＜0.01).不同质量浓度GL组干预后足细胞凋亡率均显著低于PAN组(Pa＜0.01),随GL质量浓度升高,其抗足细胞凋亡作用降低(P＜0.05).结论 PAN可呈剂量依赖性诱导足细胞损伤,50.0 mg?L-1 PAN为诱导合适的质量浓度.GL及DEX对PAN诱导足细胞损伤均有保护作用,DEX呈剂量依赖方式抑制足细胞凋亡,GL发挥抗足细胞凋亡作用与剂量有关.     

特异性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响

目的 研究特异性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对嘌呤霉素氨基核苷(puromycm ammonucleoside,PA)诱导的足细胞凋亡的影响,初步探讨特异性COx-2抑制剂对足细胞保护作用的机制.方法 以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象,分为正常对照(CON)组、PA组、塞来昔布(CEL)组和地塞米松(DEx)组.在0、8、24和48 h检测各组足细胞活性和凋亡水平,并检测足细胞凋亡过程中caspase-3的活性水平,运用western印迹法检测各组足细胞P53及COX-2的表达.结果 与CON组比较,PA、CEL、DEx组在24、48 h的足细胞凋亡率均显著升高(P值均＜0.05),但各组这两个时点间的足细胞调亡率的差异无统计学意义(P值均＞0.05).与PA组比较,CEL、DEX组在24、48 h的足细胞凋亡率均显著降低(P值均＜0.05).与CON组比较,各组细胞caspase-3活性无明显变化(P值均＞0.05).与CON组比较,PA组在24、48 h的P53、COX-2表达均显著增多(P值均＜0.05),各组这两个时间点间P53、COX-2表达的差异无统计学意义(P值均＞0.05).与PA组同时间点比较,CEL、DEX组在24、48 h的P53、COX-2的表达显著下降(P值均＜0.05).结论 PA诱导的足细胞凋亡呈时间依赖性,随时间延长,足细胞凋亡逐渐增多.PA诱导的足细胞凋亡过程中P53、COX-2的表达增加,足细胞凋亡过程与caspase-3无关.COX-2抑制剂具有抑制足细胞凋亡的作用,与地塞米松相当.     

雷至胶囊对嘌呤霉素氨基核苷肾病的减毒增效作用

目的:探讨雷至胶囊(雷公藤多苷10 mg.kg-1+女贞子、墨旱莲4 g.kg-1)在治疗嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病的减毒增效作用。方法:80只雄性大鼠随机分为8组:空白组、模型组、雷至胶囊高、低剂量组、雷公藤多苷高、低剂量组、雷公藤甲素组和缬沙坦组,每组10只。颈静脉注射PAN 100 mg.kg-1建立PAN肾病模型。空白组颈静脉注射等量生理盐水。其余各治疗组造模后第2天开始每日分别ig给药,持续10 d。第11天,处死大鼠,摘取肝肾,用于光镜、免疫荧光及透射电镜检测。结果:一般情况:模型鼠第5天尿量减少、腹水,而浮肿不明显,体重下降。第7～10天腹水明显,24 h尿蛋白增加,死亡率30%(3/10)。病理改变:模型鼠肾小管上皮细胞变性,电镜下,可见足细胞足突融合、消失,而空白组足细胞结构正常。各药物治疗组24 h尿蛋白、血生化、血红蛋白均有不同程度改善,各治疗组血尿素氮轻度升高(P<0.05)。雷至胶囊及雷公藤多苷10 mg.kg-1组降蛋白尿、改善贫血、降低AST疗效优于其余各组,电镜下,雷至胶囊高剂量组足突融合减轻,足突明显恢复。结论:雷至胶囊可能通过降低PAN肾病大鼠蛋白尿、改善贫血、降低AST、减轻足细胞足突融合及肾小管上皮细胞变性等发挥减毒增效作用。