重组慢病毒载体pLKO-1-EGFP-puro的构建

目的：构建具有绿色荧光蛋白（GFP）标记及嘌呤霉素（puro）抗性的重组慢病毒载体。方法：改建慢病毒载体质粒pLKO-1-puro的多克隆位点（MCS）,以质粒pEGFP-C3为模板扩增出CMV-EGFP并与pLKO-1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro,后者与包装质粒Δ8.2和包膜蛋白质粒VSV-G在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,感染非洲绿猴肾细胞Vero细胞,观察GFP的表达。结果：成功改建了慢病毒载体质粒pLKO-1-puro并插入了CMV-EGFP,形成了新型慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro。3质粒共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染Vero细胞后高表达绿色荧光。结论：成功构建了高效的带GFP报告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒载体。     

肾上腺髓质肽在大鼠足细胞损伤模型中调控肾小球壁层上皮细胞分化

 目的  探讨肾上腺髓质肽(adrenomedullin,AM)是否通过调控肾小球壁层上皮细胞(parietal epithelial cells,PECs)分化参与对大鼠足细胞损伤模型的保护作用及可能的分子机制。方法  雄性SD大鼠经一次性腹腔注射嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleoside,PAN) (15 mg/100 g体重)建立足细胞损伤模型,随机分为模型组和治疗组,治疗组每天经尾静脉注射AM 蛋白质(6.6 μg/100 g体重)。分别在首次注射PAN后7、14 和21 天,观察大鼠尿蛋白水平及肾组织形态改变,并经免疫组化染色、双重或三重免疫荧光染色,检测足细胞数量、肾小球AM的表达、PECs分化以及Notch3表达变化。结果  大鼠 PAN肾病模型表现为大量蛋白尿、肾小球节段性损伤、足细胞计数显著减少。AM/claudin-1双重荧光染色显示PECs中AM表达显著增强且出现于毛细血管袢内。AM治疗可改善大鼠尿蛋白及肾组织形态,减少足细胞丢失,14天时显著增加共表达PECs(claudin-1)及足细胞特异性标志蛋白(WT-1和synaptopodin)的细胞数。Ki67与claudin-1共定位表达于PECs,但未与WT-1共表达。AM显著抑制由PAN所致的Notch3表达。结论  在大鼠PAN足细胞损伤模型中,PECs中AM表达上调提示机体的一种代偿性保护机制,AM可能通过下调Notch3信号通路而促进PECs分化,参与其促进损伤后修复的作用。     

巢蛋白在足突广泛融合的肾小球中表达下调及与蛋白尿程度的相关性

目的 观察中间丝蛋白类的巢蛋白（nestin）在足突广泛融合的肾小球中的表达及其与足突病变动态过程和蛋白尿产生的关系。 方法 免疫组化法检测nestin在人正常肾组织及微小病变肾组织中的表达。构建氨基核苷嘌呤霉素肾病大鼠模型，应用免疫组化、荧光实时定量PCR、Western印迹法检测注射嘌呤霉素后第1、4、10、20天大鼠肾小球中nestin的分布与表达；电镜观察肾脏足细胞改变，测定尿蛋白量（24 h）。分析nestin的变化与蛋白尿的相关性。 结果 免疫组化显示nestin在人类微小病变肾小球中的表达较正常组织显著下调（0.93±0.08 比 1.65±0.12，P < 0.05）。在嘌呤霉素损伤足细胞早期，肾小球nestin的表达曾有一过性增加（mRNA和蛋白水平分别为对照组的1.23倍和1.48倍，P < 0.05），随后持续下降。nestin的mRNA水平在嘌呤霉素注射后第4天时降至对照组的35.8%；第10天时为对照组的12.1%（均P < 0.01）；病变好转后开始上升，恢复为对照组的65.8%（P < 0.05）。Western印迹检测nestin蛋白改变也有类似的趋势，嘌呤霉素注射后第4 天，nestin蛋白水平有所下降，为对照组的77.0%（P < 0.05）；至大量蛋白尿的第10天，nestin蛋白水平仅为对照组的58.0%（P < 0.05）；而随着病变的恢复，嘌呤霉素注射后第20天时nestin蛋白量恢复为对照的83.4%。Pearson相关分析结果显示，注射嘌呤霉素后nestin mRNA（r = －0.667，P < 0.05）及蛋白（r = －0.621，P < 0.05）表达与尿蛋白量(24 h)均呈负相关。 结论 在以足突广泛融合为特征的肾脏病变中，肾小球中间丝蛋白nestin表达显著减少，并与蛋白尿程度呈负相关，提示nestin可能参与了足细胞形态和功能的维持。     

雷公藤甲素对嘌呤霉素模型足细胞病变的影响

目的：研究雷公藤甲素对非免疫因素介导的、单纯足细胞病变模型——嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病模型的疗效及其对足细胞病变的影响。方法：采用PAN单次颈静脉注射法建立PAN肾病模型。大鼠分为正常对照组，模型组，雷公藤甲素预防组和治疗组。分别在1天、3天、5天、10天、14天和21天收集血尿标本，并处死大鼠留取肾组织标本。检测24h尿蛋白排泄量、血生化指标，行肾组织光镜和电镜观察肾小球病变和足突超微结构。采用定量学方法测定足突宽度。免疫荧光染色观察足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达和分布变化。结果：雷公藤甲素无论是预防还是治疗性用药均能明显改善PAN肾病大鼠的肾病综合征状况，明显减少尿蛋白，加快血清白蛋白回升和血脂水平恢复。与此同时，雷公藤甲素预防组和治疗组大鼠在各观察点足突融合程度和范围均比PAN肾病大鼠明显减轻，至第14天仅见少数足突融合，第21天足突形态已基本恢复正常。雷公藤甲素预防性和治疗性用药均能够增加足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达，促进其分布异常的修复。在第10天，Nephrin和Podocin不仅表达较PAN肾病大鼠明显增多，而且大部分血管袢已开始呈现连续的线状分布，以Podocin更为明显；两者的表达和分布在第14天已基本恢复，至第21天已完全恢复正常。结论：雷公藤甲素对PAN导致的足细胞损伤模型具有明显的预防和治疗作用，表现为减少蛋白尿，改善足突融合，恢复足细胞相关蛋白的表达及其分布，逆转足细胞病变。     

血管紧张素转化酶抑制剂对嘌呤霉素肾炎模型治疗及预防肾小球硬化的作用

目的研究血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)大鼠肾病模型的干预作用,评估ACEI对肾小球肾炎的治疗和延缓肾小球硬化的作用。方法分对照组(n=5),PAN组(n=5)和PAN+ACEI组(n=5)3组。选用成年雄性SD大鼠,体重200~250 g。大鼠尾静脉注射PAN 15 mg·kg-1(PAN组),对照组用同法注射等量生理盐水,PAN组于成模后给予ACEI类药物替莫普利(8 mg·kg-1·d-1)灌胃为PAN+ACEI治疗组,测定3组4、8 d与4、14及20周的血压、24 h尿蛋白定量,并观察尿蛋白、收缩压及肾组织的病理改变。结果 PAN组及PAN+ACEI组尿蛋白定量成模后第8天达峰值,在第4周自动降至正常。与对照组比较,PAN组尿蛋白在14周[(44.01±11.31)与(4.34±1.13)mg·24 h-1,P<0.05]和20周[(100.77±20.92)与(5.47±1.86)mg·24 h-1,P<0.05]时又逐渐增高,而PAN+ACEI组与PAN组比较在14周和20周的尿蛋白定量明显降低[(6.27±0.03)与(5.38±0.1)mg·24 h-1,P<0.05];肾小球硬化指数(GSI)在4、14及20周时PAN+ACEI组均较PAN组明显减低[(1.55±0.17)与(6.21±0.45)、(4.09±0.56)与(25.34±7.19)、(5.04±0.84)与(30.49±4.37)%,P<0.05]。同时,收缩压在PAN+ACEI组明显低于PAN组[(102.8±4.36)与(131.40±3.99)、(113.3±6.11)与(143.43±4.59)和(105.48±6.03)与(133.56±8.65)mm Hg,P<0.05]。结论 ACEI类药物替莫普利可以降低肾小球肾炎引起的蛋白尿,降低肾性高血压,减少肾小球硬化,从而延缓肾功能的恶化。     

Podocin在大鼠微小病变肾病模型中的表达和分布

目的:观察podocin在大鼠氨基核苷嘌呤霉素(PAN)肾病模型中的表达和分布,探讨其在蛋白尿发生中的可能作用.方法:建立大鼠PAN肾病模型,应用光镜、电镜观察肾脏病理改变,免疫荧光染色图像分析以及半定量RT-PCR的方法,分别检测不同时间点(1、3、10、20天)大鼠肾组织中podocin的表达.结果:①PAN注射后第l、3、10、20天大鼠肾小球podocin的表达强度分别为:45.03±5.10、33.35±6.41、13.58±3.73、42.34±6.65,显著低于正常对照组(54.95±6.25,P＜0.01),其中第10天的表达强度最低.podocin的表达与尿蛋白排泄量呈负相关(r=-0.786,P＜0.01);②podocin在正常大鼠肾小球沿毛细血管袢呈均匀连续的线样分布;模型第1天podocin在肾小球局部呈颗粒状分布;第3天呈弥散性的颗粒状分布;第10天呈粗大的颗粒状分布;第20天podocin的分布逐渐恢复为线样;③PAN注射后第1、3、10、20天大鼠肾小球podocin mRNA的表达分别为正常对照组的1.2、1.5和1.4倍,第20天大鼠肾小球podocin mRNA水平恢复正常.结论:PAN肾病模型大鼠肾小球podocin蛋白表达分布异常及其量的减少与大鼠蛋白尿的发生密切相关.     

IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的作用

目的:研究支架蛋白IQGAP1在足细胞骨架重组中的作用。方法:用嘌呤霉素(PAN)刺激小鼠足细胞,实时定量PCR检测IQGAP1mRNA的表达,免疫印迹法检测足细胞IQGAP1蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架F-actin分布,F-actin肌动蛋白评分系统(CFS)分析骨架重组;IQGAP1siRNA和IQGAP1质粒转染足细胞,分别观察下调和上调足细胞IQGAP1表达对嘌呤霉素诱导足细胞细胞骨架重组的改变。结果:嘌呤霉素刺激足细胞后IQGAP1mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),足细胞F-actin分布发生明显重组;转染IQGAP1siRNA,嘌呤霉素刺激足细胞F-actin重组进一步加重;转染IQGAP1质粒,嘌呤霉素刺激足细胞F-actin重组减轻。结论:IQGAP1可能参与嘌呤霉素诱导的足细胞细胞骨架重组。     

MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质。结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加。结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常。     

1,25(OH)2D3对嘌呤霉素氨基核苷酸肾病大鼠足细损伤的保护作用

目的 观察1,25(OH)2D3对嘌呤霉素氨基核苷酸肾病（PAN）大鼠足细胞损伤的保护作用并探讨可能的作用机制。方法 72只SD大鼠随机分为正常对照组（NC）、PNA组（PAN）和1,25(OH)2D3治疗组（T）。一次性尾静脉注射PAN 100mg/kg体重建立PAN肾病动物模型。于3、7、14、21d分批处死动物,分别检测不同时间点24h尿蛋白和肾功能,PAS染色和透射电镜观察肾组织学改变,RT-PCR、免疫组化、western-blot分别检测nephrin,BMP-7, p-Smad1/5/8的表达。结果①PAN大鼠24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐均高于同期的NC组,且足细胞足突增宽融合;T组各时间段24h尿蛋白和肾功能较PAN组显著降低（P<0.05）,肾脏病理改变减轻。②与NC组比PAN大鼠nephrin表达减少并由正常的沿毛细血管襻线状分布向颗粒状、团快状改变。T组大鼠nephrin的表达显著增强且保持着正常的沿毛细血管襻线状分布。③PAN组BMP-7 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad1/5/8的表达均低于NC组;T组BMP-7 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad1/5/8的表达显著升高。结论 1,25(OH)2D3能有效的抑制嘌呤霉素氨基核苷酸诱导的足细胞损伤,减少蛋白尿; 1,25(OH)2D3对足细胞损伤的保护作用可能与调控BMP-7信号的活化有关。     

健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的O2^—及NO的影响

目的进一步探讨健肾片对慢性肾炎的疗效及作用机理。方法运用嘌呤霉素腹腔注射所致肾病大鼠病理模型。经用化学发光法检测实验动物的超氧阴离子,采用硝酸还原酶化学比色法检测ＮＯ含量。结果发现该药可减轻嘌呤霉素肾病大鼠的病理变化,减低模型动物的血和红细胞Ｏ－２含量,提高其ＮＯ含量。结论健肾片具有调整自由基反应和增加血ＮＯ的生物活性作用