双链腺相关病毒介导表达Exendin-4治疗糖尿病大鼠的研究

目的 构建、鉴定自身互补双链DNA的腺相关病毒(scAAV)重组载体,使其分泌表达Exendin-4,检测其转导效率并观察在糖尿病大鼠模型中的治疗作用.方法 应用基因工程方法改建穿梭质粒pSSHG-CMV,插入外源性基因Exendin-4,构建重组scAAV载体,感染HEK293细胞,ELISA检测转染NIH3T3细胞上清Exendin-4滴度,链佐霉素诱导20只6周龄体质量180 ～220 g SD成年雄性大鼠为糖尿病鼠模型,逆向注射重组scAAV于糖尿病大鼠颌下腺,检测其血糖及胰岛素分泌水平.结果 重组scpSSHG/exn4可有效包装和复制,病毒滴度为2.5×1011 pfu/mL,转染细胞上清分泌Exendin-4浓度可达到4.53 ng/mL,scAAV治疗组血糖浓度在2、4周及8周均低于对照组[分别为(639.17±27.89) vs(396.00±34.00),(657.02 ±39.87) vs (315.62±42.56),(215.6±24.7) vs (458.6±19.7) mg/dL],胰岛素浓度均高于对照组[分别为(156.8 ±24.5)vs(535.9±35.6),(236.5±12.3) vs (495.3 ±18.6),(620.43 ±46.90) vs (381.56±21.78) pg/mL],二者比较有显著统计学差异(P＜0.05).结论 成功构建重组双链腺伴病毒scAAV-Ex-4,具有高效转导能力,对糖尿病大鼠模型具有控制血糖及增加胰岛素分泌作用.     

评价自身抗体联合检测在诊断自身免疫性疾病中的应用

目的探讨检测抗核抗体（ANA）核型与抗可提取性核抗原（ENA）抗体及抗双链DNA（ds,DNA）抗体之间的相关性,提高对自身免疫性疾病（AID）的诊断及鉴别诊断参考价值。方法资料来源门诊及住院的AID病例血清标本进行检测,ANA检测采用问接免疫荧光法（IIF）,抗ENA抗体检测采用欧蒙斑点法（抗nRNP／SIn、Sm、SSA／Ro、SSB／Lo、Scl-70和Jo—1）六项抗体及抗（ds—DNA）抗体采用ELISA法检测。结果在98例ANA阳性病例血清标本中核型分布为：细胞核均质型（36．74％）,细胞核颗粒型（41．84％）,细胞核仁型（11．22％）,细胞核膜型（1．02％）,细胞核着丝点型（1．02％）;重叠核型中细胞核均质型／细胞核颗粒型（2．04％）,细胞核均质型／细胞浆颗粒型（6．12％）等。98例ANA与ENA同时阳性血清标本中42例抗双链DNA抗体阳性（42．86％）。36例均质型阳性样本中抗SSA／Ro抗体（24．48％）,抗SSB／Lo抗体（6．12％）,抗nRNP／Sm抗体（6．12％）。41例细胞核颗粒型阳性样本抗nRNP／Sm抗体（19．39％）,SSAfRo抗体（15．31％）,抗SSB／Lo抗体（6．12％）。ANA阳性可出现一种或多种自身抗体。结论ANA常见核型有：细胞核颗粒型,细胞核均质型及细胞核仁型。ANA均质型核型检出的抗ds-DNA抗体为主,且抗ds—DNA抗体含量与荧光强度成正比。ANA核型与抗ENA抗体二者之间有一定的相对应性。ANA及核型、抗ENA抗体和抗ds—DNA抗体的联合检测可明确诊断AID,而且利于判断患者血清中各种自身抗体与临床表现的关系。     

系统性红斑狼疮患者血清免疫检查结果分析

目的：分析系统性红斑狼疮患者的血清免疫检查结果。方法：46例系统性红斑狼疮患者治疗前后检查血清抗结核抗体、抗双链DNA抗体,免疫球蛋白含量、补体3、白介素-6、肿瘤坏死因子-α测定等,并与同期健康体检者血清指标对比。结果：观察组ANA阳性39例,检出率为84.78%;抗双链DNA抗体阳性27例,检出率为58.70%;观察组治疗前TNF-α、IL-6、IgG、C3均显著高于对照组（P〈0.05）,观察组治疗后TNF-α、IL-6、IgG、C3与对照组比较均无显著性差异（P〉0.05）。结论：系统性红斑狼疮患者的血清免疫检查对疾病诊断及病情观察有重要意义。     

多项指标检测系统性红斑狼疮的临床意义

目的 探讨可提取核抗原(ENA)多肽抗体谱、抗双链DNA(dsDNA)抗体、免疫球蛋白和补体对系统性红斑狼疮(SLE)的诊断价值.方法 测定84例SLE患者及90例健康人血清自身抗体、补体和免疫球蛋白;测定45例经4个月治疗后SLE患者的自身抗体、补体和免疫球蛋白水平.结果 84例SLE患者的抗dsDNA、抗Sm-D1、抗Ro/SS-A60、抗Ro/SS-A52、抗SSB、抗U1-SnRNP、抗Histon、抗Po 和抗Nucle检测阳性率分别为73.8%、84.8%、83.3%、61.9%、45.2%、42.9%、33.3%、30.9%和9.5%;SLE 患者免疫球蛋白值明显高于健康对照组,补体C3 、C4 明显低于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).45例SLE患者治疗4个月后血清抗dsDNA、抗Sm-D1、抗Ro/SS-A60、抗Ro/SS-A52、抗SSB、抗U1-SnRNP、抗Histon、抗Po 和抗Nucle检测阳性率分别为55.6%、55.6%、88.9%、55.6%、55.6%、22.2%、22.2%、11.1%和33.3%.结论 自身抗体、免疫球蛋白及补体联合检测有助于SLE的诊断分型和预后评估.     

FOXO3a介导PTEN对DNA修复基因RAD51表达的调节作用

目的探讨转录因子FOXO3a在PTEN调节RAD51表达中的作用。方法利用Western印迹技术分析PTEN缺陷与否时,总FOXO3a以及细胞核内FOXO3a磷酸化的情况;转染外源AKT到PTEN野生型细胞或外源PTEN和失去激酶活性的AKT（AKT-DN）到PTEN缺陷型细胞,Western印迹检测核内FOXO3a的磷酸化情况。结果 PTEN缺失导致细胞核内FOXO3a磷酸化水平增高;外源PTEN可以降低PTEN缺陷型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平,外源AKT可以增加PTEN野生型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平;沉默FOXO3a在一定程度上导致RAD51表达水平下降。结论 FOXO3a可以结合到RAD51基因的启动子区,PI3K/AKT/FOXO3a信号通路是PTEN调节RAD51表达的重要方式之一。     

自身抗体联合检测对狼疮性肾炎的诊断价值

目的:探讨抗dsDNA、抗LPL和抗Clq单项检测和联合检测在LN诊断中的价值.方法 将77例SLE患者分为A组（LN组、38例）和B组（非LN组,35例）,比较抗dsDNA、抗LPL和抗Clq单项及联合检测与LN的关系.结果 在A组患者中抗dsDNA、抗LPL、抗Clq单项和联合检测阳性率均显著高于B组(P＜0.05).3种自身抗体联合检测与单项检测比较,敏感性有所降低,但特异性明显提高.结论 三项联合检测可早期诊断出LN.     

天冬氨酸及赖氨酸2～10肽单链和双链的合成与毒性

目的探讨同种氨基酸形成多肽的毒性和应用前景。方法用固相合成法合成天冬氨酸和赖氨酸的2~10肽单链与双链化合物,通过小鼠尾静脉将这些化合物注射到小鼠肝脏内,观察它们对小鼠的致死作用(LD50)。结果当天冬氨酸单链2~10肽的浓度依次达到0.15、0.1、0.09、0.03、0.0065、0.03、0.034、0.035和0.04 mol/L时,小鼠的死亡率达到50%。当赖氨酸单链2~10肽的浓度依次达到0.28、0.1、0.047、0.0225、0.0028、0.00166、0.0015、0.0011和0.00075 mol/L时,小鼠的死亡率达到50%。当天冬氨酸-赖氨酸双链2~10肽的浓度依次得到0.5、0.05、0.017、0.014、0.009、0.006、0.004、0.004、0.004、0.004 mol/L时,小鼠的死亡率达到50%。结论单链多肽的毒性大于双链多肽。在2~6肽范围内,天冬氨酸单链多肽随着氨基酸数目增加毒性逐渐增加;相反,在7~10肽范围内,随着氨基酸数目的增加毒性逐渐降低。在2~10肽范围内,赖氨酸单链多肽随着氨基酸数目增加毒性逐渐增加。在2~6肽范围内,天冬氨酸-赖氨酸双链多肽随着氨基酸数目增加毒性逐渐增加;但在7~10肽范围内,其毒性相似。     

三种检测方法检测抗dsDNA抗体的临床意义

目的探究将绿蝇短膜虫间接免疫荧光法、欧蒙酶免疫斑点法以及胶体金快速斑点法应用于检测抗双链DNA(dsDNA)抗体中的效果。方法120例系统性红斑狼疮患者,根据病情不同分为疾病活动组及疾病稳定组,每组60例;同时选取60例健康体检者作为对照组。分别采用绿蝇短膜虫间接免疫荧光法、欧蒙酶免疫斑点法以及胶体金快速斑点法对三组研究对象的抗双链DNA抗体进行检测,分析三种检测方式的检测阳性率。结果绿蝇短膜虫间接免疫荧光法对疾病活动组患者抗双链DNA抗体的检测阳性率为95.00%(57/60),对疾病稳定组患者的检测阳性率为71.67%(43/60),对对照组的检测阳性率为5.00%(3/60);欧蒙酶免疫斑点法对疾病活动组患者抗双链DNA抗体的检测阳性率为76.67%(46/60),对疾病稳定组患者的检测阳性率为61.67%(37/60),对对照组的检测阳性率为10.00%(6/60);胶体金快速斑点法对疾病活动组患者抗双链DNA抗体的检测阳性率为80.00%(48/60),对疾病稳定组患者的检测阳性率为65.00%(39/60),对对照组的检测阳性率为8.33%(5/60)。三种检测方法对疾病活动组患者抗双链DNA抗体的检测阳性率高于疾病稳定组、对照组,疾病稳定组高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);绿蝇短膜虫间接免疫荧光法对系统性红斑狼疮患者抗双链DNA抗体的检测阳性率为83.33%(100/120),均高于欧蒙酶免疫斑点法的69.17%(83/120)、胶体金快速斑点法的72.50%(87/120),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论三种诊断方式对于抗双链DNA抗体均具有较高的诊断阳性率,并且在对患者的各个时期进行诊断时,产生的诊断效果较为良好,而三种诊断方式应用于患者的诊断中,可以选择联合诊断,这样有助于避免误诊或者漏诊。     

HLCDG1基因siRNA表达质粒的构建及其对A549细胞周期和增殖的影响

目的:本研究旨在应用RNA干扰技术，诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。 方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体，筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。 结果:根据siRNA表达载体的设计原则，构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个（4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组），依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4 和 pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染A549细胞，筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的A549细胞，它几无HLCDG1基因表达，这株细胞暂命名为A549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明，A549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高，进入S期和G2+M期增多，滞留G1期减少。 结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达，验证了HLCDG1基因对A549肺癌细胞有生长抑制作用。     

miR-34s增强结直肠癌细胞对放射敏感性的作用研究

目的:探讨miR-34s对结直肠癌细胞放射敏感性的影响以及在电离辐射致DNA损伤中的作用。方法:利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative fluorescence PCR,qRT-PCR）检测miR-34a/b/c-5p在结直肠癌细胞中的表达水平,以及电离辐射后miR-34a/b/c-5p表达水平变化趋势。基于克隆形成法和单击多靶模型建立细胞存活曲线,分析miR-34a/b/c-5p对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。过表达miR-34a/b/c-5p并进行照射,利用免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点形成情况,进而分析miR-34a/b/c-5p对电离辐射致DNA损伤的作用。结果:miR-34a/b/c-5p在HCT116细胞中的表达水平明显高于HT29细胞（P＜0.05）。HCT116细胞经4 Gy照射后24 h内,miR-34a/b/c-5p表达水平呈双峰变化趋势。与miR-NC组相比,过表达miR-34a/b/c-5p可显著增加结直肠癌细胞的放射敏感性,miR-34a/b/c-5p组细胞平均致死剂量（D0）和准阈值剂量（Dq）均明显降低,且辐射增敏比（SER）明显增加。过表达miR-34a/b/c-5p可显著增加电离辐射诱导的DNA双链断裂（double strand breaks,DSBs）水平,照射后1 h和8 h γH2AX焦点数明显高于miR-NC组（P＜0.05）。结论:miR-34s为放射响应miRNA分子,过表达miR-34s可增加电离辐射诱导的DNA损伤水平并增强结直肠癌细胞的放射敏感性。