激光扫描共聚焦显微镜观察冻存对SHR卵母细胞的影响

目的 冻存未受精的成熟卵母细胞（MII期）比冻存同一品系的处于卵裂期的胚胎更困难。因为卵母细胞的某些内部结构对低温很敏感。本研究的目的是希望能够更有效地观察冻存对卵母细胞的影响。方法 我们运用激光扫描共聚焦显微术（CLSM）的光学切片和三维图像重建技术,研究冻存对自发性高血压大鼠（SHR）卵母细胞的结构,尤其是对纺锤体、染色体的影响,以及冻存对体外受精的影响。结果 我们不仅观察到有的卵母细胞冻存后仍维持着完整的桶状纺锤体以及紧密排列的染色体,而且能观察到卵母细胞内均匀分布着细胞质微管星体。冻存也造成对一些卵母细胞纺锤体和细胞质微管星体的破坏。结论 CLSM能够清晰有效地观察冻存对未受精卵纺锤体、染色体以及胞质微管星体的影响,我们推想冻存后卵母细胞的体外受精率下降与这些结构的受损有关。     

卵母细胞冷冻保存的研究进展

卵母细胞冷冻保存技术越来越多地应用于人类辅助生殖,但冷冻保存效率和冷冻损伤仍然制约其在临床上的普遍应用。冷冻保存会引起皮质颗粒的提前释放,透明带硬化;还会影响纺锤体和染色体的形态及超微结构,最终降低卵母细胞的发育能力。因此,需进一步研究卵母细胞冷冻损伤的机制,改进冷冻保护剂和冷冻方法。     

巯基乙酸对小鼠成熟卵母细胞皮质颗粒分布和MAPK活性的影响

背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid ,TGA)对小鼠卵母细胞胞浆成熟和相关生化指标的影响.材料与方法:以不同浓度TGA(0.2、1.0、2.5 mmol/L)体外培养小鼠卵母细胞,并设M16培养液对照组,培养16 h后在体视显微镜下,观测卵母细胞生发泡破裂和第一极体排出情况,用免疫荧光染色方法对皮质颗粒(cortical granules,CGs)进行标记,采用western blot方法对p44/42MAPK进行检测.结果:各组生发泡破裂率均达到90%左右,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).随着TGA剂量的增加,第一极体排出率下降,各剂量组和对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).各剂量组均可观察到CGs在细胞膜下的线状排列,但随着TGA吼剂量的增加,质膜下CGs的密度降低,胞浆中CGs的密度有增加的趋势.对照组卵母细胞中有非常明显的无皮质颗粒区(cortical granules free domain,CGFD)形成,0.2 mmol/L组也形成了CGFD,但1.0 matol/L和2.5 mmol/L两个剂量组未观察到CGFD.1.0 mmol/L和2.5mmol/L TGA可抑制p44/42MAPK的活化.结论:TGA可影响小鼠卵母细胞细胞质成熟和MAPK的活性,具有一定的生殖毒性.     

巯基乙酸对孕酮诱导爪蟾卵母细胞体外成熟过程中MAPK和MPF激酶活性的影响

背景与目的:探讨巯基乙酸(TGA)对孕酮诱导爪蟾卵母细胞体外成熟过程中丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和成熟促进因子(MPr)蛋白激酶活性的影响.材料与方法:用0、5、25和125 μg/ml浓度的TGA分别处理经孕酮诱导的体外培养爪蟾卵母细胞,另设不含孕酮的阴性对照组,于处理4 h和8 h收集卵母细胞进行Western Blotting检测,观察p-Erkl/Erkl蛋白、p-RSK蛋白、Cdc2、p-Cdc2和Cyclin BI蛋白的表达情况.结果:TGA处理爪蟾卵母细胞4 h后,Erkl蛋白的磷酸化水平(即MAPK的活性水平),较对照组明显增加(P＜0.05);MAPK的活性底物p-RSK蛋白的表达也增加(P＜0.05);同时伴随着p-fAc2表达水平的下降和Cyclin B1蛋白表达的增强(P＜0.05).TGA处理8 h后Erkl蛋白磷酸化水平和p-RSK蛋白含量与对照组相比无明显差异(P＞0.05),但此时TGA组p-Cdc2水平明显增加(P＜0.05),Cyclin BI蛋白的表达降低(P＜0.05).结论:在孕酮诱导的爪蟾卵母细胞体外成熟早期,TGA可促进MPF和MAPK蛋白激酶及其底物p-RSK的活化;在成熟的晚期,TGA对MAPK活性无明显影响,但明显抑制MPF活性.TGA影响MPF活性的可能机制是降低Cyclin B1蛋白水平.     

p21-EGFP 融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位

目的:通过构建绿色荧光蛋白p21-EGFP融合基因表达载体,观察其在小鼠卵母细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对小鼠卵母细胞细胞周期的影响提供实验基础.方法:以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA , 应用基因重组技术与EGFP 基因融合, 构建以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-p21.利用显微注射方法注射到小鼠卵母细胞中进行表达,用荧光显微镜直接观察pEGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位, Western Blot 方法检测其蛋白的表达.经酶切证实插入片断的正确性.结果:荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C3转染的小鼠卵母细胞中,绿色荧光呈弥散分布,而经注射重组质粒pEGFP-p21 的小鼠卵母细胞中, 绿色荧光主要集中在细胞核内.同时用Western Blot 证实了pEGFP-p21 融合基因的表达.结论:成功的构建了pEGFP-p21 融合表达质粒.同时证明小鼠卵母细胞能高效表达pEGFP-p21 融合基因, 且主要定位于细胞核内.     

In-vitro Maturation of Immature Oocytes from Preantral Follicles in Prepuberal Mice

Objective To observe the morphological changes in in vitro growth of preantral follicle isolated from prepuberal mice and to assess impacts of gonadotropin （Gn）, insulin transferrin selenium （ITS） and epidermal growth factor （EGF） on their development. Methods Early preantral mice follicles （90-130μm diameter） were mechanical isolated and selected from 2 weeks＇ old mice and then cultured in alpha-minimal essential medium （α-MEM） with or without Gn, ITS and EGF. The preantral follicles were cultured singly in 20 miovliters droplets for up to 14 d. The medium was replaced and the .follicles were observed everyday. Granulosa cells （GC） prolification, antrum formation and oocyte maturation were recorded. Results The medium with Gn supported preantral follicle culture in vitro, during which they retained a three-dimensional structure, maintained oocytes viability and increased in diameter and number of somatic cells＇. Preantral follicles cultured in Gn medium grew obviously, while those without Gn grew slowly and after 6 d＇s culture began to shrink and blacken. Significant increase in survival rate and maturation rate of oocytes was observed in Gn group （P〈0.01）, with 92.9% survived and 28.7%formed an antrum. Further supplementation of the Gn medium with ITS and rLH, resulted in the significant increase in survival and maturation of preantral follicle （P〈0.05） Conclusions α-MEM can be the medium for in vitro culture （IVC） of preantral follicles, but need to be added with rLH/rFSH, rHCG/rEGF to facilitate thecal cell attachment, GC proliferation and oocyte maturation.     

药物诱发小鼠生殖细胞及早期胚胎非整倍体的研究

本文用超排卵技术使雌性小鼠排卵,排卵前用药物或化学物处理后与雄性小鼠交配,以小鼠卵母细胞(MⅡ)及第一次分裂合子雌原核染色体非整倍体及结构畸变为指标,研究其诱变作用。结果表明,对照组小鼠卵母细胞(MⅡ)及第一次分裂合子均未发现有染色体非整倍体及结构畸变。处理组中,环磷酰胺和乙醇可诱发小鼠卵母细胞(MⅡ)及第一次分裂合于雌原核染色体非整倍体率增加,醋酸棉酚、氯氮平、苯妥英钠及安定则无明显影响。     

外源性化学物在卵母细胞成熟中的作用

系统综述了外源性化学物对卵母细胞减数分裂成熟的影响及其作用机制。有研究表明,外源性化学物中的双酚丙烷、对叔辛基苯酚、邻苯二甲酸酯类、有机氯类、金属类等都可干扰正常卵母细胞的成熟过程,但各种外源性化学物的作用机制不尽相同。     

PCOS患者窦状卵泡卵母细胞结构变化的研究

目的:探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者窦状卵泡卵母细胞结构变化。方法:对37例因不孕就诊且药物治疗无效的PCOS患者进行腹腔镜下多囊卵巢电凝穿刺或卵巢楔形切除术;共收集窦状卵泡卵母细胞121枚,在光学显微镜下进行观察。术后随访受孕情况至少半年,将患者分为妊娠组及未孕组,所得资料进行统计分析。结果:37例患者中有27例妊娠,观察其89枚卵母细胞,23例异常;未受孕10例中观察32枚卵母细胞,19例异常。术后PCOS未孕组卵母细胞异常的例数显著高于妊娠组(P<0.01)。结论:PCOS患者窦状卵泡自身卵母细胞结构异常导致卵泡未能发育成熟为优势卵泡,是顽固性PCOS患者不孕的主要因素之一。