真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段（2,061 bp）,并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3＇端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

TNFα基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

如同联合应用两种具有协同作用的细胞因子可以达到更佳的免疫治疗效果一样，如果将两种具有协同作用的细胞因子基因共转染人一种肿瘤细胞内，此肿瘤细胞可能会具有更佳的抗肿瘤效果。IL-2和TNFα具有协同抗肿瘤作用和免疫调节作用。因此，本文选用IL-2基因和TNFα基因为共转染的目的基因，通过两步基因转移共转染人B16黑色素瘤细胞，观察了体内致瘤性和瘤苗效果。     

成骨诱导因子Nell-1及Noggin短发卡RNA联合转染脂肪间充质干细胞的促成骨分化能力

背景:Nell-1在诱导成骨分化和新骨形成中的作用已有报道,但试图通过双基因联合转染起协同成骨作用的研究很少。目的:体外环境下抑制细胞中Noggin基因的同时上调Nell-1基因,观察其对脂肪间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:取健康成年大鼠脂肪组织获取脂肪间充质干细胞。将细胞分为3组,对照组转染空载体病毒Lv-EGFP(增强型绿色荧光蛋白),Nell-1组单纯转染Lv-Nell-1,Nell-1+Noggin shRNA组同时转染Lv-Nell-1和Lv-Noggin shRNA。转染后3,7,14 d,应用实时荧光定量PCR检测Nell-1及成骨相关标志物(Col-Ⅰ、ALP、OCN)的表达,转染后14 d行茜素红染色。结果与结论:①转染后3 d,对照组Nell-1 mRNA相对表达量与Nell-1组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。与Nell-1+Noggin shRNA组比较,对照组和Nell-1组Nell-1 mRNA表达量偏低,差异均有显著性意义(P<0.05)。转染后7,14 d,Nell-1+Noggin shRNA组Nell-1 mRNA相对表达量仍高于对照组和Nell-1组,且Nell-1组高于对照组,两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);②转染后3,7,14 d,Nell-1+Noggin shRNA组各成骨基因mRNA相对表达量均显著高于对照组和Nell-1组,且Nell-1组高于对照组,组间比较差异有显著性意义(P<0.05);③转染后14 d,Nell-1+Noggin shRNA组呈现较多细胞聚集形成的结节,Nell-1组钙结节数量少于Nell-1+Noggin shRNA组,对照组未见明显被染色的钙结节;④实验结果表明,Nell-1基因可以促进大鼠脂肪间充质干细胞成骨分化,而干扰Noggin基因会上调Nell-1基因的表达,形成显著的协同成骨分化作用。     

B7.1及SEA基因共转染肝癌细胞的初步研究

目的获得可表达共刺激分子B7.1和超抗原分子SEA的肝癌细胞株,检测其表达。方法用免疫组织化学方法,筛选表达B7.1及SEA的肝癌细胞阳性克隆。用流式细胞仪检测B7.1表达的阳性率,ELISA检测上清中SEA的含量。结果获得表达B7.1和SEA的肝癌细胞株,培养上清中SEA的含量达10～14×10     

山姜素激活孕烷X受体和上调CYP3A4 mRNA转录的研究

目的探讨山姜素能否通过活化孕烷X受体(PXR)诱导CYP3A4的转录表达及对CYP3A4 mRNA的实际诱导作用。方法在人结肠癌LS174T细胞中,用瞬时共转染报告基因实验研究山姜素(1～50μmol.L-1)对PXR介导的CYP3A4基因的转录激活;用荧光定量RT-PCR方法检测其对CYP3A4 mRNA的实际诱导。结果 10μmol.L-1浓度山姜素能够通过活化PXR诱导CYP3A4的转录(1.63倍);10和20μmol.L-1山姜素能够明显上调CYP3A4 mRNA(2.28倍和1.65倍)的表达。结论 PXR途径也许是山姜素诱导CYP3A4基因表达的调控因素之一。     

针对HBV S基因发夹状siRNAs表达载体的构建及其在HepG2215细胞中对HBV基因表达的抑制作用

目的探讨通过载体在体外培养的细胞中表达发夹状siRNAs对HBV基因表达的抑制作用。方法构建表达针对HBV S基因mRNA的发夹状siRNAs的质粒pSilencer 2.1-U6-S,并与ayw亚型HBV全基因组表达质粒共转染体外培养的HepG2215细胞,用半定量RT-PCR分析目标mRNA表达丰度的变化,用ELISA法观察HBsAg表达的变化。结果siRNA处理组细胞上清中HbsAg和HBeAg含量分别比空白对照组降低了63.4%和68.0%,细胞中的2.1kb的信使RNA降低了75.2%。结论siRNA在体外培养的细胞中能有效地抑制HBV基因的表达。     

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的：构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法：双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体（Lenti-SOX9-GFP）,以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体（Lenti-LMP1-RFP）。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论：测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9（NM_000346）及LMP1（AF345904.1）基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。