小鼠子宫蜕膜基质细胞的分离培养

目的:蜕膜组织的细胞成分相当复杂,其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75%,其能分泌多种细胞因子,既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境.实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法,为进一步建立蜕膜细胞共培养系统将为研究病理性妊娠打下良好的基础.方法:实验于2006-09/2008-01在泰山医学院实验动物中心,SPF级实验室完成.①实验材料:8～10周龄C57BL/6雌性小鼠,由北京维通力化实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:选用孕龄6～8 d的C57BL/6小鼠蜕膜组织进行体外培养,采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化,进行全组分蜕膜细胞培养,采用原代细胞过夜换液方法清除红细胞、淋巴细胞和不贴学的细胞成分,利用传3代方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯.纯化后,观察蜕膜基质细胞的生长变化规律,制作细胞爬片,用催乳素免疫组织化学试剂盒检测培养细胞的成分.结果:①小鼠蜕膜基质细胞在接种24 h后大部分已贴壁,贴壁生长的细胞成纤维母细胞状,一般培养5-7 d后细胞融合成单层.原代培养的蜕膜基质细胞在含10%胎牛血清的培养液中可增生数周,四五天传代1次,传代后的细胞形态无明显变化,而传代培养极性渐不明显.②免疫组织化学显示,体外培养传代后95%阳性细胞为蜕膜基质细胞,细胞大小形状基本均一,染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒,且越近胞核染色越深.结论:采用复合酶消化,换液传代方法提纯蜕膜组织,方法简单、经济实用,并可获得较高纯度的蜕膜基质细胞.     

肾小管上皮细胞传代培养

长期传代的肾小管上皮细胞系已被广泛地研究。目前国内外应用较多的有MDCK、LLC－PK1、OK、VEPT和EPT细胞系。本文就这些细胞系及其性质做一介绍。     

成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能,但骨髓中间充质干细胞的含量极少,因此体外纯化和扩增极其重要。目的:拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法,观察其增殖及生长特性。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。材料:骨髓血来源于成人肋骨骨髓。方法:收集成人骨髓血,采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞,根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80℃条件下冻存,24h后复苏,观察活细胞数,按2×103/cm2种植扩增,扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。主要观察指标:倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞抗原表达,采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。结果:原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆,散在分布,大部分细胞呈纺锤形。7~9d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍;10~12d,细胞数量增加了约20倍,铺满了全层,细胞排列也有一定的方向性,呈旋涡样生长,旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105,不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示,第2~6天为生长潜伏期,第8~10天进入对数增长期,第12~14天进入个平台期;传代培养的潜伏期为24~48h,对数增长期为4~6d,细胞的增殖、生长逐渐缓慢,接种后8到9天进入平台期。结论:利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力,表达CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。     

日本血吸虫尾蚴细胞的传代培养及抗原性检测

目的 探索体外培养日本血吸虫尾蚴细胞的增殖与传代技术。 方法 无菌收集日本血吸虫活尾蚴5 000～10 000条,置于含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中,用组织刀快速割切尾蚴使成组织碎裂物,加入250 U蟹胶原酶在26℃下孵育30 min,然后离心去酶,加入含有青霉素(100 U/ml)、链霉素(O.1 mg/ml)、两性霉素B(0.25μg/ml)和适量促细胞生长物的RPMI 1640改良培养基中作原代培养,当贴壁细胞增殖长满瓶底时,以1:2的接种率进行传代培养;获取第5代培养细胞作ELISA检测血吸虫病患者血清中抗体。 结果 在原代培养的第3天可见尾蚴组织的周围有呈单个存在或索状排列的发亮细胞,第10天可见单层细胞形成,第14天贴壁细胞长满瓶底并作传代培养;在传代培养中可见细胞呈均匀生长,每7～14 d传代一次;用第5代培养细胞作抗原,检测31例患者的阳性率为90.3％,检测30名正常人血清的假阳性率为6.7％。 结论 日本血吸虫尾蚴细胞体外传代培养至第5代,可用于免疫学研究。     

胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾细胞消化方法的研究

目的:考察不同胰蛋白酶及消化后是否弃去胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞消化效果的影响,并评价培养基中添加胎牛血清对减轻胰蛋白酶细胞毒性的作用。方法:选用5种胰蛋白酶分别消化MDCK细胞,消化5 min后弃去胰蛋白酶为弃去组,不弃去为保留组。观察消化...     

人脂肪源性血管外膜细胞的分离培养和生物学功能分析

目的 建立人脂肪源性血管外膜细胞(CD146+ hAD-PC)体外分离纯化及培养的可行性方法,并进行生物学特性鉴定和分化能力分析.方法 通过胶原蛋白酶消化法及多参数流式细胞术从人脂肪组织中分离纯化CD146+ hAD-PC(CD146+CD34-CD144-CD45-),并进行体外培养扩增,倒置显微镜下连续观察不同时期...     

昆明小鼠iPS细胞传代培养方法的优化研究

目的:探索不同胰蛋白酶序贯传代方法对小鼠诱导多潜能干(iPS)细胞培养的影响。方法:利用不同胰蛋白酶序贯方法消化小鼠iPS细胞(实验组),与传统的单一胰蛋白酶传代方法(对照组)进行比较,利用流式细胞学计数技术比较2组消化后的细胞中iPS细胞的比例。结果:iPS细胞所占比例在实验组、对照组分别为60.25%、47.06%,有显著性差异(P<0.01)。结论:用不同胰蛋白酶序贯消化方法对小鼠iPS细胞进行传代培养,可提高小鼠iPS细胞的纯度,有利于小鼠iPS细胞的扩增培养。     

表皮生长因子对不同区域角膜上皮细胞体外传代培养的影响

目的　观察表皮生长因子 (EGF)对角膜上皮细胞体外传代培养的影响。方法　用抗 Brdu抗体标记法 ,流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果　对照组 :中央部细胞传代次数为 ( 5± 1)代 ,周边部的为 ( 7± 1)代 ,角膜缘部的为 ( 8±2 )代。EGF组 :角膜中央及周边部上皮细胞传代次数分别提高 ( 1± 1)及 ( 2± 1)代 ;角膜缘部的增加 ( 5± 1)代。结论　角膜缘细胞在添加EGF后 ,细胞体外传代有显著提高 (P <0 .0 1)。由此提示 :通过进一步改善培养条件 ,体外延长角膜缘部细胞的存活是可能的     

大鼠脑组织神经元培养、纯化、传代、鉴定

目的：探讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：取SD新生大鼠，胰蛋白酶消化、离心，原代培养出神经元和神经胶质的混合细胞；振摇法和胰蛋白酶消化法去掉小胶质和星形胶质，传代培养神经元，免疫细胞化学法鉴定培养神经元的纯度。结果：第三次传代培养细胞，NF抗体标记阳性细胞遍布整张盖片，仅有零星散在CD68和GFAP阳性细胞。结论：本实验传代、培养的细胞高纯度的神经元，为后续实验打下了基础。     

日本血吸虫成虫体外传代培养细胞的生物学鉴定

本研究结果显示：血吸虫成虫细胞在体外培养中呈半悬浮聚集生长状态, 4代内的培养细胞及冻存复苏细胞存活率达90%，并在各代培养中均可见细胞分裂相；传5代细胞的染色体核型为8对16条。超微结构既观察到形态正常细胞，也可见形态异常细胞。表明1640?鄄40特定培养基对血吸虫成虫中的部分细胞体外传代培养获得成功。