人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

人脐静脉内皮细胞的培养和连续传代

本实验用新生小牛视网膜提取物作血管内皮细胞生长促进剂,成功地使人脐静脉内皮细胞在体外连续培养23代以上。细胞倍增时间平均为16.6h,细胞传代时间平均为5 d,传代比率为1:2～1:3。用ABC法证明细胞内存在Ⅷ因子相关抗原(FⅧr-Ag),透射电镜下可见胞浆内含WP(Weibe1-Palade)小体,证实所培养的细胞为血管内皮细胞。     

三种环境雌激素对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

[目的 ]探讨环境中常见的三种类雌激素壬基酚 (NP)、双酚A(BisA)和邻苯二甲酸二丁酯 (DBP)影响人乳腺癌细胞T47D增殖和凋亡的分子生物学作用机制。 [方法 ]T47D细胞在含 10 %胎牛血清的DMEM培养液中进行常规传代培养 ,实验前将细胞转移至无酚红DMEM(含 5 %活性碳葡聚糖苷处理过的FBS)中继续培养 5d ,收集细胞 ,PBS洗涤后接种于内置盖玻片的 6孔板或 75ml培养瓶中 ,用 3 2× 10 -7mol/LNP、3 2× 10 -7mol/LBisA及 3 2× 10 -6mol/LDBP对细胞分别处理 72h ,用半定量RT PCR技术观察这 3种化合物对核增殖抗原PCNA、bcl 2及baxmRNA表达的影响 ,并用免疫组化方法对结果进行验证。 [结果 ]与溶剂对照组相比 ,NP和BisA对T47D细胞处理 72h可显著抑制baxmRNA表达而促进bcl 2和PCNAmRNA的表达 ,随后的免疫组化实验也证实了这一结果 ;DBP可促进PCNAmRNA及蛋白的表达 ,但对bcl 2及bax的表达未见统计学意义。 [结论 ]环境雌激素NP和BisA可通过调节PCNA、bcl 2及bax的表达而调节乳腺癌T47D细胞的增殖和凋亡作用。DBP通过促进核增殖抗原PCNA的表达而促进T47D的增殖作用     

人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

目的：研究人龈上皮细胞体外原代和传代培养，建立能够体外长期培养的人龈上皮细胞系。方法：取健康龈组织块，经0．25％分离酶作用后．将上皮组织与其下的结缔组织分离，0.125％胰酶消化上皮组织形成细胞悬液，接种培养。当细胞汇合达80％时，1：2传代培养。结果：获得的原代培养细胞表达细胞角蛋白，结合细胞形态。可初步认定为龈上皮细胞。原代培养的人龈上皮细胞部分可以传代培养到第3代。结论：建立能够长期体外培养的龈上皮细胞系具一定可行性。     

AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义

BACKGROUND: Endplate cartilage degeneration initiates intervertebral disc degeneration. AMP-activated protein kinase (AMPK) regulates the formation and degradation of cartilage. OBJECTIVE: To explore the role of AMPK in an in vitro natural degeneration model of chondrocytes derived from endplate of rat intervertebral discs. METHODS: Morphology of in vitro subcultured endplate chondrocytes of rat intervertebral discs at passages 0, 2, and 5 were observed under an inverted microscope following cytoskeleton staining. Chondrocyte phenotype, proliferation, and the cartilage marker genes (type II collagen, proteoglycan, SOX-9, matrix metalloproteinase-3 and -13), and AMPK phosphorylation were determined by toluidine blue staining, MTT assay, real-time PCR analysis, and western blot assay, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: The altered morphology, decreased proliferation ability, and phenotype loss were observed in chondrocytes with increased passage number. Gene expression of type II collagen, proteoglycan, SOX-9 was significantly decreased; while gene expression of matrix metalloproteinase-3 and -13 was significantly increased in endplate chondrocytes at passage 5 compared with those at passages 0 and 2. AMPK phosphorylation in endplate chondrocytes at passage 5 was significantly decreased. These findings indicate that AMPK phosphorylation is involved in in vitro natural degeneration of chondrocytes derived from the endplate of rat intervertebral discs, and the degeneration of endplate chondrocytes and intervertebral discs can be inhibited through the regulation of AMPK activity. 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

细胞分裂与癌发生机制研究进展

基于肿瘤病理及流行病学的长期观察,结合细胞生物学新成就,发现常见肿瘤发生与细胞分裂潜能关系密切。细胞分裂是个体生长发育及组织损伤后再生修复时必不可少的生物学行为,由于细胞分裂潜能是有限的,频繁分裂将使局部细胞的分裂潜能提前耗竭,籍此发生的细胞重新选择为细胞永生化、恶性变创造了条件。     

体外传代培养对人视网膜色素上皮细胞免疫调控能力的影响

目的:研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮(human reti-nal pigment epithelialium,HRPE)细胞免疫调控能力的影响。方法:建立HRPE细胞与异体淋巴细胞共培养系统,采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞(第1、2、3、4、5、6代)Fas表达以及诱导异体淋巴细胞凋亡能力的差异。结果:HRPE与淋巴细胞体外共培养时,HRPE细胞Fas表达随着传代逐渐减弱,Fas表达与传代代数呈负相关(阳性细胞率r=-0.859,P<0.01;平均荧光强度r=-0.880,P<0.01),HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡随着传代逐渐减弱,淋巴细胞凋亡率与传代代数呈负相关(r=-0.838,P<0.01),共培养时传代HRPE细胞Fas表达迅速下降,至第3代与第4代间Fas表达差异无统计学意义(P>0.05),共培养时传代HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡率迅速下降,至第3代与第4代间淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:体外传代培养的HRPE细胞,传代数越大细胞变异越大,第3代后细胞的免疫调控能力明显下降。     

四种培养基分离培养细菌进行鞭毛染色应用

鞭毛为细菌特殊结构之一,以形态学上鉴别细菌种类的一种方法.通常需要一定的培养(或传代培养),以碱性复红酒精饱和液配成染液进行细菌鞭毛染色,方法较烦琐.我们在该方法的基础上,采用日常工作常用四种培养基对细菌分离培养并直接进行鞭毛染色,现报告如下.     

小鼠子宫蜕膜基质细胞的分离培养

目的:蜕膜组织的细胞成分相当复杂,其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75%,其能分泌多种细胞因子,既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境.实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法,为进一步建立蜕膜细胞共培养系统将为研究病理性妊娠打下良好的基础.方法:实验于2006-09/2008-01在泰山医学院实验动物中心,SPF级实验室完成.①实验材料:8～10周龄C57BL/6雌性小鼠,由北京维通力化实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:选用孕龄6～8 d的C57BL/6小鼠蜕膜组织进行体外培养,采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化,进行全组分蜕膜细胞培养,采用原代细胞过夜换液方法清除红细胞、淋巴细胞和不贴学的细胞成分,利用传3代方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯.纯化后,观察蜕膜基质细胞的生长变化规律,制作细胞爬片,用催乳素免疫组织化学试剂盒检测培养细胞的成分.结果:①小鼠蜕膜基质细胞在接种24 h后大部分已贴壁,贴壁生长的细胞成纤维母细胞状,一般培养5-7 d后细胞融合成单层.原代培养的蜕膜基质细胞在含10%胎牛血清的培养液中可增生数周,四五天传代1次,传代后的细胞形态无明显变化,而传代培养极性渐不明显.②免疫组织化学显示,体外培养传代后95%阳性细胞为蜕膜基质细胞,细胞大小形状基本均一,染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒,且越近胞核染色越深.结论:采用复合酶消化,换液传代方法提纯蜕膜组织,方法简单、经济实用,并可获得较高纯度的蜕膜基质细胞.