食管癌相关基因4在体外纯化培养大鼠脉络丛上皮细胞中的表达研究

目的：研究食管癌相关基因4（esopageal cancer related gene 4,ECRG4）在体外培养条件下大鼠脉络丛上皮细胞（choroid plexus epithelial cells,CPECs）中表达的情况。方法：分离纯化培养新生1 d斯泼累格·多雷大鼠（Sprague-Dawley rats,SD Rats）CPECs,并进行传代培养,分为原代培养组（A组）、传1代培养组（B组）和传2代培养组（C组）、原代培养干预组（D组,使用氯化锰给予毒化）,并应用qRT-PCR法、Western blot法及ELISA法分别检测ECRG4在各组CPECs中的表达情况。结果：①qRT-PCR法检测ECRG4 mRNA在原代培养和传代培养的CPECs中的表达：B组ECRG4 mRNA表达高于A、C 2组,差异具有统计学意义（P=0.000）,A、C 2组差异无统计学意义（P=0.127）。D组与A组比较表达明显降低,差异有统计学意义（P=0.001）。②Western blot法ECRG4蛋白在原代培养和传代培养的CPECs中的表达：B组ECRG4蛋白表达水平明显高于A组及C组,C组ECRG4蛋白表达水平明显高于A组,差异具有统计学意义（P=0.000）。A组ECRG4蛋白表达水平明显高于D组,A、D 2组ECRG4蛋白表达水平的差异具有统计学意义（P=0.000）。③ELISA方法检测ECRG4在原代培养和传代培养的CPECs中的分泌情况：B组高于A、C 2组,A组高于C组,差异具有统计学意义（P=0.000）。而A、B 2组差异无统计学意义（P=0.131）。结论：通过对ECRG4在CPECs中的表达研究,提示ECRG4可能参与CPECs对损伤的反应,并影响了CPECs的生物学特性,为ECRG4在神经再生中的作用研究奠定理论和实验基础。     

两种支架材料与颌下腺细胞体外复合培养的比较研究

目的将颌下腺细胞分别与颌下腺脱细胞基质(SGAM)生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,比较两种不同支架材料的生物相容性。方法用传代培养第2代的颌下腺细胞分别与SGAM生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,在一定时间通过扫描电镜观察细胞在不同支架材料上的生长情况。结果颌下腺细胞在SGAM生物衍生支架材料上,多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,数量较多,大小不等,形态各异,表面凸凹不平,突起丰富;表面结构似“银耳”状。而细胞在胶原海绵支架材料上大多附着在材料表面,数量较少,突起较少。结论颌下腺脱细胞基质支架材料与胶原海绵支架材料相比具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料。     

血吸虫细胞培养首次获得成功

易新元、曾宪芳教授与张中庸、李靓如教授新近合作 ,在我校血吸虫病研究室对日本血吸虫进行了细胞培养研究。采用血吸虫尾蚴一定部位的组织 ,经无菌培养获得了原代和传代细胞。细胞呈圆形 ,生长稳定 (见附图 ) ,现正进行传代培养中 ,下一步拟进行染色体分析、生长曲线及分裂指数测定、氚标胸腺嘧啶核苷酸掺入及放射自显影等 ,以最终建立日本血吸虫细胞系 ,为血吸虫生理生化、药物作用及免疫等研究提供新的材料来源。此前血吸虫细胞培养历经几代学者的不懈努力未能获得成功。本次从日本血吸虫尾蚴体细胞首获传代培养是这一重要虫种生物学研究中的重大突破 ,可望对血吸虫病疫苗和寄生虫—宿主相互关系研究以及血吸虫基因结构—功     

细胞的传代培养（基础）

细胞传代培养就是将原代培养的细胞．用胰蛋白酶消化分散后，再转入次级培养基内，进行继续培养．也叫转代培养。     

大鼠胸导管内皮细胞的体外培养和观察

目的 体外培养大鼠胸导管内皮细胞，为研究淋巴管内皮细胞的生理功能、病理改变以及分子水平调节等提供手段。方法 术前用脂肪喂食大鼠，标记胸导管，将胸导管两端结扎，取下胸导管后充分分离和剪碎，在RP—MI1640培养液中直接培养，观察胸导管内皮细胞的生长。结果 胸导管内皮细胞呈铺路石样生长，Ⅶ因子相关抗原呈阳性反应。结论 此法简便易行，是获取淋巴管内皮细胞的一种可靠的方法。     

关于改善细胞培养实验教学质量的几点建议

细胞培养是医学细胞生物学实验教学的重要内容，由于此技术作为实验、研究工作的基本步骤．已广泛应用于各学科的多项领域，通过学习，使学生了解细胞培养的基本知识，初步掌握基本的培养技术及观察、检测方法．为其今后进一步学习及科研、实验奠定基础。它能提高学生的实际操作能力．是做好医学细胞生物学其他实验的基础和前提。细胞培养是指细胞在体外条件下的培养技术，即在无菌条件下．从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件．让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。细胞培养分为原代培养和传代培养。而原代培养是细胞培养中最为重要的．它是传代培养的前提，也是有关医学细胞生物学后续实验如传代培养、细胞骨架、细胞融合和染色体提前凝集等实验的重要基础，如果原代培养不能成功．后继实验将无法进行。细胞培养简化了环境因素，排除了体内实验时一些复杂因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律；便于应用各种不同的技术和方法观察和研究细胞结构和功能的变化；可以长期观察和研究细胞遗传行为的改变；同时提供大量生物性状相同的细胞．特别是人的活细胞材料作为研究对象，不仅耗费少，比较经济，关键是解决了不能用人做实验的问题。     

成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能，但骨髓中间充质干细胞的含量极少，因此体外纯化和扩增极其重要。 目的：拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法，观察其增殖及生长特性。 设计、时间及地点：单一样本观察实验，于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓血来源于成人肋骨骨髓。 方法：收集成人骨髓血，采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞，根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80 ℃条件下冻存，24 h后复苏，观察活细胞数，按2×103/cm2种植扩增，扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。 主要观察指标：倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞抗原表达，采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。 结果：原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24 h后贴壁细胞数量明显增多, 3 d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆，散在分布，大部分细胞呈纺锤形。7~9 d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍；10~12 d，细胞数量增加了约20倍，铺满了全层，细胞排列也有一定的方向性，呈旋涡样生长，旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105，不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示，第2~6天为生长潜伏期，第8~10天进入对数增长期，第12~14天进入个平台期；传代培养的潜伏期为24~48 h，对数增长期为4~6 d，细胞的增殖、生长逐渐缓慢，接种后8到9天进入平台期。 结论：利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力，表达CD105、KDR，不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性鉴定

目的 建立人胎儿骨髓间充质干细胞(MMSCs)的分离、培养方法,观察MMSCs形态学、细胞生物学及细胞表型,以获得大量人源性MMSCs。 方法 收集12个人胎儿的骨髓,采用细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,用显微摄像、四甲基偶氮唑盐(MTT)和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫细胞化学鉴定其表型。 结果 0.5~2 h内尽快分离骨髓细胞,24 h换液后可获得约(300±8.0)个贴壁细胞,5个细胞以上的集落为(15±6)个;培养细胞在种植后1~3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入平台期;细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线基本类似,在达到对数生长期后,分裂相细胞明显减少。原代及传代培养显示,细胞分裂旺盛,可观察到干细胞特有的不均等分裂,5~7 d可传1代,连续传10代后,每个人胎儿来源MMSCs可扩增达1011-1012个细胞。MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。对传代MMSCs进行人甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18免疫细胞化学分析,细胞除表达微量甲胎蛋白外,不表达白蛋白和细胞角蛋白18。 结论 人胎儿MMSCs分离成分单纯,容易成功,增殖旺盛,在普通培养条件下不向肝细胞分化。MMSCs作为组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。