植物源性转基因食品PCR检测技术研究

〔目的〕建立简便、快速、灵敏、特异的植物源性转基因食品DNA检测技术。〔方法〕针对转基因植物技术中载体上常用花椰菜花叶病毒的 3 5S启动子和根农杆菌的NOS终止子特异基因序列 ,设计合成特异的引物对 3 5s -f/ 3 5s-r、Nos -f/Nos -r ,利用基因PCR扩增技术检测植物源性转基因食品。〔结果〕引物对 3 5s -f/ 3 5s -r、Nos -f/Nos -r分别成功从转基因大豆中扩增出 195bp和 180bp特异的DNA带。采用引物对 3 5s -f/ 3 5s -r进行PCR时检测灵敏度为每反应 10 4分子 ;采用Nos -f/Nos -r时检测灵敏度为 2× 10 4分子。最低可以对 0 .1μg转基因大豆进行检测。〔结论〕基于 3 5S启动子和NOS终止子基因序列的PCR扩增技术是一种简便、快速、灵敏、特异的植物源性转基因食品DNA检测技术     

实时定量PCR检测体外诱导条件下小鼠骨髓基质细胞S100mRNA表达水平变化

目的:检测S100 mRNA含量,初步探讨骨髓基质细胞体外诱导条件下向雪旺细胞样细胞分化的可能性。方法:采用差速贴壁的方法分离、培养小鼠骨髓基质细胞。经β-ME,ATRA,Forskolin,bFGF,PDGF,HRG体外诱导后,利用实时定量PCR检测S100 mRNA水平的变化。结果:诱导后,骨髓基质细胞S100 mRNA水平上升,诱导前后水平变化有统计学意义(P<0.05)。结论:实时定量PCR检测S100 mRNA含量具有较高的灵敏度和特异性。体外诱导后骨髓基质细胞S100 mRNA表达量增多。     

ELISA法检测急性血吸虫病患者血清HBV标志物时假阳性排除方法探讨

目的探讨ELISA法测定急性血吸虫病(下称急血)患者HBV标志物时假阳性的排除方法。方法将90例急血患者血清行抗干扰处理和未抗干扰处理,然后同时进行ELISA法检测HBV5项标志物,并且对该90例患者均进行HBVDNAPCR定量检测。结果进行抗干扰处理的标本HBV5项标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的阳性率依次分别为16.7%、38.9%、4.4%、27.8%、32.2%;未进行抗干扰处理的标本该5项标志物的阳性率依次分别为58.9%、67.8%、15.6%、43.3%、48.9%,HBV5项标志物的阳性率前者明显低于后者;HBVDNAPCR定量检测的阳性率为17.8%。且抗干扰处理后患者HBV5项标志物组合显示HBV现症感染的阳性率与HBVDNAPCR的阳性率相近。结论该血清标本抗干扰处理法是急血患者ELISA法测定HBV标志物时假阳性排除较有效的方法。     

人类α-actin 启动子真核表达载体的构建

目的 利用PCR技术克隆了人类α-actin 基因的启动子(约450 bp).方法 将PCR产物连接到pMD-18T载体上,酶切鉴定后测序,并进行软件分析.结果与结论 序列分析表明,扩增片段虽然与GenBank里登陆的序列同源性仅为72%,但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列.用去掉启动子的pEGFP-N1作为框架结构,尝试构建真核表达载体,并获得了含人类心肌α-actin启动子的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P.     

近交系小鼠H-2基因的PCR检测方法

目的建立快速、灵敏、简便的H-2基因检测方法。方法针对近交系小鼠的H-2D区和H-2K区序列,设计两对特异性引物,分别进行DNA扩增,扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,确定H-2基因型。结果通过PCR反应扩增小鼠H-2D区和H-2K区的基因产物,可以区分不同的近交系小鼠的H-2基因型,进而可以区分出不同品系的近交系小鼠。结论利用分子生物学方法进行近交系小鼠遗传学检测,弥补了过去各种方法的不足,并且PCR方法还具备快速、简便、成本低廉、便于普遍推广并易于和国际接轨等优点。所以通过PCR方法可以进行小鼠H-2基因型检测。     

狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立检测狂犬病毒（RV）核蛋白（N）基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RVN基因保守区域设计特异性引物与探针；优化检测体系中引物与探针的浓度；以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型；考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性；初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性，使用浓度分别为0．6μmol／L和0．2μmol／L，可检测到2700个RNA拷贝数，较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍；同一样品Ct值重复检测5次，变异系数均〈5％，表明检测体系具有较好的稳定性；通过所建立的检测体系，绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线，对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测，并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。     

氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化

目的 探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子（TIF3）p36 mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索.方法 应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,以及敏感先进的Taqman荧光定量PCR方法,检测并分析氯化镉诱发16HBE恶性转化不同阶段即转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞的TIF3 p36 mRNA表达量的变化.结果 相对于非转化对照细胞（16HBE）,氯化镉诱发恶性转化不同阶段细胞（转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞）的TIF3 p36 mRNA基因表达水平均明显升高（P＜0.01或P＜0.05）,其中低剂量组（5 μmol/L）所转化的各阶段细胞的eIF3 p36 mRNA平均表达量分别是对照细胞的3.1、5.9和9.9倍,中剂量组（10 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7.1、6.8和14.8倍,高剂量组（15 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3 p36平均表达量分别是对照细胞的3.6、3.0和9.1倍.这些不同剂量组的研究结果提示,eIF3 p36的异常表达量与氯化镉诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系,但与镉的剂量无关.结论 氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的蛋白翻译启动因子eIF3 p36异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一.     

TIMP-2逆转录病毒载体的构建及表达

目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP-2）编码序列基因逆转录病毒表达载体，转染人单核细胞白血病细胞株，为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础。方法根据基因库中已公布的序列设计引物，用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段，用限制性内切酶及T4连接酶将目的片段插入MSCV逆转录病毒载体中。采用酶切和PCR鉴定及测序后经脂质体介导转染至PT67包装细胞中，以病毒上清感染单核细胞白血病细胞株SHI-1，G418筛选，极限稀释法挑选单克隆细胞株，定量PCR和Western Blotting检测TIMP-2的表达。结果TIMP-2基因克隆进逆转录病毒载体MSCV中，经酶切、PCR和DNA测序证实重组逆转录病毒载体构建正确，病毒上清感染SHI-1细胞，经G418筛选并挑选出单克隆细胞，经实时定量PCR和Western Blotting检测发现SHI-1细胞中TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建了高表达TIMP-2的SHI-1细胞，可对其生物学行为作进一步研究。     

食品标本处理方法对大肠埃希菌检出限影响

目的 研究快速、敏感、低成本的食品标本处理方法。方法 在牛肉馅中接种不同浓度的大肠埃希菌O157：H7，经离心、过滤，去除PCR抑制剂。浓缩菌株，用煮沸法和酶／冻融法裂解菌株，制备模板DNA。通过PCR检测大肠埃希菌O157：H7志贺毒素基因以评价该处理方法的可行性。结果 在未增菌条件下，PCR最低能检测到103CFU／g牛肉馅，增菌6h，最低能检测1CFU／g牛肉馅，整个检测过程只需要12h。结论 所采用的标本处理方法是一种灵敏、省时、低成本的方法，能显著地提高PCR检测食品标本中的大肠埃希菌O157：H7的灵敏度。     

儿童社区获得性肺炎肺炎支原体感染的快速诊断

目的:探讨儿童社区获得性肺炎(CAP)肺炎支原体(MP)感染的快速诊断方法,以帮助临床正确选择抗生素。方法:将159例经逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)证实为MP感染的住院患儿随机分为A、B、C三组,分别进行血清特异性IgM、IgG及双份血清补体结合实验,同时设立健康对照组。结果:A组53例中MP特异性IgM阳性48例(90·57%);B组53例检出MP特异性IgG阳性35例(66·4%);C组53例患儿分别于入院第1d及至少10d后收集双份血清进行补体结合实验,共采集标本50人份,证实为MP阳性的46例(92·00%);MP-IgM检测结果还具有年龄差异,3岁以下组的阳性率低于3岁以上组(P<0·05);50例健康儿童MP-IgM阳性1例(2·00%),MP-IgG阳性7例(14·00%),双份血清实验检测未见阳性。结论:MP血清特异性IgM检测是早期快速诊断儿童MP感染的有效手段,但其结果具有年龄组的差异,婴幼儿MP感染的诊断还需结合PCR及双份血清实验。