砷及MPST过表达对SH-SY5Y细胞GRP78/CHOP通路的影响

目的探讨内质网应激是否参与亚砷酸钠(NaAsO2)神经毒性损伤,明确3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)过表达是否调节砷诱导的内质网应激。方法通过构建MPST基因慢病毒表达载体来获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株作为SH-MPST过表达组,另设空载体转染细胞为SH-PEB组,染砷组(NaAsO2组),内质网应激阻断剂TUDCA组,TUDCA预处理染砷组。Western blot法分别检测过表达MPST、染砷及TUDCA预处理后细胞内GRP78和CHOP蛋白表达的变化。结果单纯MPST过表达不影响SH-SY5Y细胞内GRP78、CHOP蛋白的表达水平;经NaAsO2处理后,SH-PEB细胞内GRP78、CHOP蛋白明显上调(P<0.01),而被内质网应激阻断剂TUDCA所拮抗;MPST过表达则抑制砷对GRP78、CHOP蛋白的上调(P<0.01);然而,TUDCA预处理则明显逆转MPST过表达对GRP78、CHOP蛋白的影响(P<0.01)。结论GRP78/CHOP内质网应激通路参与了砷诱导的神经毒性损伤;MPST过表达可降低砷诱导的内质网应激水平。     

1,8-桉叶油素调节自噬改善高糖诱导的内皮细胞损伤

目的探讨1,8-桉叶油素(1,8-Cineole)通过调节自噬来改善高糖(HG)诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤的保护作用。方法采用HG作用HAECs 60 h,不同剂量的1,8-Cineole进行干预,运用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞毒性,Western blot法检测Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9的蛋白表达,及使用自噬抑制剂氯喹(CQ)作用HAECs后,检测Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9的表达情况。结果1,8-Cineole提高细胞活力,减少LDH含量,激活自噬和抑制细胞凋亡。与空白组比较,CQ组的Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9表达增加,同时观察到CQ+HG+CH组与CQ+HG组比较时,以上蛋白差异均无统计学意义。结论1,8-Cineole对高糖诱导HAECs损伤具有保护作用,其作用与改善自噬流相关。     

甘草泻心汤调控PERK-elF2α-CHOP信号通路保护应激态肠上皮细胞屏障的机制

目的从PERK-elF2α-CHOP信号通路角度观察甘草泻心汤(GXD)对内质网应激(ERS)状态肠上皮细胞(IECs)的保护作用。方法培养Caco-2细胞,分为正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、GXD低剂量(GXD-L)、中剂量(GXD-M)和高剂量组(GXD-H)。衣霉素(Tm)诱导建立应激态细胞模型,GXD各组造模同时予中药含药血清干预。CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率和周期分布,跨膜电阻抗(TEER)和FITC-dextran示踪法共同明确细胞屏障通透性,Western blot法检测PERK-elF2α-CHOP通路蛋白的表达。结果与MC组相比,GXD干预后能提高细胞存活率(P<0.05),降低其凋亡率(P<0.01),缓解细胞周期阻滞(P<0.01),升高细胞TEER值(P<0.01)、降低FITC-dextran浓度(P<0.05)以改善细胞屏障通透性;GXD-M和GXD-H组中p-PERK、p-elF2α、ATF4和CHOP蛋白水平均明显降低(P<0.01)。结论GXD可通过抑制PERK-eIF2α-CHOP凋亡通路的信号转导,从而减少IECs的过度凋亡,保护肠上皮细胞屏障稳态。     

槲皮素对胃癌相关p53/AMPK/mTOR信号通路的影响

目的　探讨槲皮素（QE）对胃癌相关p53/AMPK/mTOR信号通路的影响。方法　将胃癌细胞分为QE组和溶剂组,QE组以DMSO为溶剂按配制QE浓度分别为0.02、0.04、0.06及0.08 mmol/L,对细胞进行干预,分别为QEA、QEB、QEC、QED组,溶剂组加入等量不含QE的溶剂。MTT实验检测槲皮素对胃癌细胞增殖的影响;MDC染色法检测槲皮素对胃癌细胞自噬的影响;双染法检测槲皮素对胃癌细胞凋亡的影响;实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞内p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平;Western blot检测细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P53、AMPK、mTOR蛋白表达差异。结果　与溶剂组相比,QE各剂量组胃癌细胞的自噬程度和凋亡率均显著增加,细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量上调,p53、AMPK mRNA和蛋白水平均上调,mTOR的mRNA和蛋白表达量均下调（P＜0.05）,且呈剂量依赖性。结论　QE可以抑制胃癌细胞增殖,诱导其发生自噬、促进其凋亡,其作用机制可能与p53/AMPK/mTOR信号通路有关。     

A novel Diels–Alder adduct of mulberry leaves exerts anticancer effect through autophagy-mediated cell death

Guangsangon E (GSE) is a novel Diels–Alder adduct isolated from leaves of Morus alba L, a traditional Chinese medicine widely applied in respiratory diseases. It is reported that GSE has cytotoxic effect on cancer cells. In our research, we investigated its anticancer effect on respiratory cancer and revealed that GSE induces autophagy and apoptosis in lung and nasopharyngeal cancer cells. We first observed that GSE inhibits cell proliferation and induces apoptosis in A549 and CNE1 cells. Meanwhile, the upregulation of autophagosome marker LC3 and increased formation of GFP–LC3 puncta demonstrates the induction of autophagy in GSE-treated cells. Moreover, GSE increases the autophagy flux by enhancing lysosomal activity and the fusion of autophagosomes and lysosomes. Next, we investigated that endoplasmic reticulum (ER) stress is involved in autophagy induction by GSE. GSE activates the ER stress through reactive oxygen species (ROS) accumulation, which can be blocked by ROS scavenger NAC. Finally, inhibition of autophagy attenuates GSE-caused cell death, termed as “autophagy-mediated cell death.” Taken together, we revealed the molecular mechanism of GSE against respiratory cancer, which demonstrates great potential of GSE in the treatment of representative cancer.     

Rictor对小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞线粒体钙信号的调控

目的: 探索Rictor在小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞（ESC-CM）中的表达、定位及其对线粒体钙信号的调控作用。方法: 通过经典"悬滴-悬浮-贴壁"三步法建立ESC-CM模型。利用免疫荧光法及蛋白质印迹法观察Rictor在ESC-CM中的定位。慢病毒技术干扰小鼠胚胎干细胞Rictor表达后,采用免疫荧光法考察ESC-CM内质网与线粒体的叠加情况;通过透射电镜观察ESC-CM的超微结构;活细胞工作站测定分化后心肌细胞线粒体钙瞬变;免疫共沉淀法检测ESC-CM中1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）、葡萄糖调节蛋白75（Grp75）、线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）间的相互作用;蛋白质印迹法检测线粒体融合蛋白2（Mfn2）的表达情况。结果: Rictor在ESC-CM中主要定位于内质网及线粒体-内质网结构偶联（MAM）域,且其表达定位与线粒体及内质网有很好的叠加。干扰Rictor后,心肌细胞线粒体部分呈散点状,线粒体与内质网的叠加率降低（P < 0.01）;ESC-CM超微MAM形成减少;ATP刺激引起的ESC-CM线粒体钙瞬变幅度下降,其中钙瞬变斜率和上升峰值均降低（均P < 0.01）;MAM中IP3R、Grp75、VDAC1相互作用明显减弱,且Mfn2蛋白表达降低（P < 0.01）。结论: 干扰小鼠胚胎干细胞中Rictor表达可降低ESC-CM中钙从内质网到线粒体的释放,这可能是通过影响IP3R、Grp75、VDAC1间相互作用,减少Mfn2表达,进而破坏MAM来实现的。     

肺动脉高压形成中的血管重构分子生物学机制研究进展

肺动脉高压（PAH）是以肺动脉压和肺血管阻力升高为特征的临床血流动力学症候群,可导致右心衰竭和死亡。血管重构是PAH最显著的组织病理学特征,其形成受多方面因素的调控。内质网应激、钙紊乱和线粒体功能紊乱通过调节细胞内钙稳态和细胞代谢调控血管细胞的增殖凋亡能力;表观遗传学现象（如DNA损伤和微小RNA表达异常）参与调控血管细胞的异常增殖;血管细胞表型转化（包括内皮细胞间质转化和平滑肌细胞表型转换）是引起血管细胞异常增殖的重要原因。血管重构由多种细胞和分子通路共同作用产生,针对多靶点来改善PAH中发生的异常血管重构,进而延缓甚至逆转PAH的进程,有望成为PAH治疗上新的突破口。     

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与自噬调控作用的研究进展

自噬是机体保守的自我防御机制,是将细胞内变形坏死的细胞器和多余蛋白降解为小分子,以供循环利用。自噬在生理和病理状态下均发挥重要作用,可通过多条信号通路影响胞内物质的表达。目前已知Ras/Raf/MEK/ERK信号通路不仅广泛参与调控细胞生长、增殖、分化、凋亡等多个生理病理过程,并且参与调控自噬,并具有促进肿瘤细胞发生自噬性死亡的作用,但是其具体参与调控自噬的作用机制尚未完全阐明。本文就Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与调控自噬的作用的研究进展进行详细阐述,以期为研究Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调控自噬的作用机制提供参考。     

右旋硫辛酸对人肝癌HepG2细胞生长增殖及其相关机制研究

研究天然抗氧化剂右旋硫辛酸对人肝癌HepG2细胞生长、增殖的影响及其相关机制。采用MTT检测细胞增殖情况,活性氧试剂盒分析细胞内ROS水平。流式细胞术和Hoechst 33258染色观察细胞凋亡和形态变化。Western blot检测凋亡、自噬以及相关通路蛋白表达,包括Bax、Bcl-2、caspase 3、PARP、ATG5、ATG7、LC3、Beclin1、mTOR、P70S6K、P38、P53、ERK、Akt、MEK等。结果表明,经不同浓度不同时间药物处理,右旋硫辛酸可抑制HepG2细胞增殖,提高细胞内ROS水平,并呈时间和剂量依赖性。右旋硫辛酸通过上调促凋亡蛋白Bax,激活caspase家族,从而激活凋亡效应蛋白caspase 3和PARP,同时右旋硫辛酸还可上调自噬相关蛋白ATG5、ATG7、Beclin1、LC3水平,抑制磷酸化mTOR和P70S6K,激活自噬。通路研究表明:右旋硫辛酸可上调磷酸化的P38和JNK促凋亡通路促进凋亡,抑制磷酸化Akt、ERK的表达。添加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤后,明显抑制自噬发生。因此,右旋硫辛酸可能通过调控P38/AMPK-JNK,PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK途径激活自噬,诱导细胞凋亡。