DR E2基因参与酵母内质网应激调控机制的初步研究

目的：初步研究 DRE2基因在抗肿瘤药物衣霉素诱导的内质网应激中的作用机制。方法以质粒pRS306为模板,通过 PCR 扩增含有 URA3开放阅读框的 DRE2基因破坏元件 der2：URA3,然后利用基因重组原理,构建 DRE2基因杂合缺失酵母菌株,并进一步检测其对衣霉素的抗性和复制寿命。结果相对于野生型菌株,DRE2基因杂合缺失酵母菌株对衣霉素的抗性增高,复制寿命缩短（P＜0．05）。结论 DRE2基因可能参与了酵母内质网应激和衰老的调控。     

青蒿琥酯通过活性氧自噬途径增加小鼠巨噬细胞杀菌活性

目的 研究青蒿琥酯(artesunate,AS)通过增加小鼠巨噬细胞的自噬水平进而上调其杀菌活性的药理作用及机制.方法 分离及体外分化培养获得原代小鼠骨髓巨噬细胞.细菌计数实验分为大肠埃希菌(E.coli,EC)组、EC+ AS组和EC+AS+抑制剂组(3-MA和Ly294002),建立EC感染细胞模型,给予AS和抑制剂处理,采用平板培养法检测胞内活菌数量.自噬和活性氧检测实验分为medium组、AS组、AS+自噬抑制剂组和AS+活性氧清除剂组[还原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)],RT-PCR和Western blot法检测自噬体标志物的表达,荧光探针法检测胞内活性氧水平.结果 经定向分化后,获得形态良好的原代巨噬细胞.细菌计数实验结果显示,与EC组比较,EC+ AS组细胞胞内EC数量显著减少(P＜0.01),且具有剂量和时间效应关系.EC+ AS+自噬抑制剂组和EC+AS+活性氧清除剂组细胞胞内细菌较EC+ AS组显著升高(P＜0.01).自噬和活性氧检测结果显示,sAS组较medium组自噬基因LC3B和Atg5的mRNA和蛋白表达均明显升高,且具有剂量效应关系(P＜0.01).AS+自噬抑制剂组或AS+活性氧清除剂组自噬蛋白的表达较AS组明显降低,AS+活性氧清除剂组ROS水平较AS组也显著降低(P＜0.05).结论 青蒿琥酯能够增加巨噬细胞的杀菌活性,且该作用与其上调细胞活性氧水平,进而激活细胞自噬效应有关.     

性激素对老龄大鼠颏舌肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶活性及其基因表达的影响

目的:观察雌、雄激素对老龄大鼠颏舌肌细胞肌浆网(SR)Ca2 -ATP酶活性及其基因表达的影响,探索性激素影响上气道稳定性的机制.方法:将24只老龄雄性大鼠随机分为3组:老龄对照组、老龄雌激素组(肌注苯甲酸雌二醇,每次0.1 mg/kg,每周2次,共4周)和老龄雄激素组(肌注丙酸睾酮,每次2.5 mg/kg,每周2次,共4周).采用定磷法检测颏舌肌SR Ca2 -ATP酶活性,荧光定量RT-PCR测定SR Ca2 -ATP酶mRNA表达的变化.结果:与对照组相比,老龄雌激素组颏舌肌SR Ca2 -ATP酶活性[前者34.24 ± 6.14 μmol Pi/(mg protein·hour),后者 38.39 ± 8.49 μmol Pi/(mg protein·hour)]及其mRNA表达水平(前者0.029 7 ± 0.014 0,后者0.031 4 ± 0.017 4 )差异无统计学意义(P＞0.05);老龄雄激素组SR Ca2 -ATP酶活性[22.91 ± 4.56 μmol Pi/(mg protein·hour)]下降到对照组的67%(P＜0.01),其mRNA表达水平(0.017 2 ± 0.008 6)亦明显下降(P＜0.05).结论:雄激素可能通过降低颏舌肌SR Ca2 -ATP酶活性、抑制其mRNA的表达而影响老龄大鼠颏舌肌的功能;而雌激素没有此项作用.     

孕期炎症刺激对子代大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨孕期炎症刺激对子代大鼠心肌纤维化的影响.方法 8只SD孕鼠采用随机数字表法完全随机分为:对照组(Con)和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激组,每组4只.分别在孕第8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理盐水或LPS (0.79 mg/kg).仔鼠6、8、10、12、16周龄测尾动脉血压;组织切片Masson染色观察心肌组织纤维化;透射电镜观察心肌显微结构;实时荧光定量PCR检测心肌组织缝隙连接蛋白(Connexin,Cx) 43、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、DNA甲基转移酶-1(DNA methyltransferase 1,DNMT-1) mRNA表达水平;Western blot检测Cx43、LC3B、DNMT-1蛋白表达.结果 与Con组子代相比,LPS组子代大鼠6、8、10、12、16周龄时血压均明显升高(P＜0.01);心肌组织胶原沉积增多,细胞间缝隙连接减少,自噬小体数量增加;Cx43和DNMT-1 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05),而LC3B的mRNA表达水平显著下降(P＜0.05);Cx43蛋白表达水平较Con组子代明显降低(P＜0.05),LC3BⅡ/LC3B Ⅰ和DNMT-1的蛋白表达水平均明显增加(P＜0.05).结论 孕期炎症刺激可导致子代大鼠心肌纤维化.这可能与孕期炎症刺激子代大鼠心肌组织自噬活化及Cx43蛋白表达降低相关.     

雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制研究

目的 探讨雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测雷公藤甲素对U251细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(IC50);免疫荧光化学法测定细胞中LC3-Ⅱ表达,Western blot法测定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表达.结果 雷公藤甲素作用于U251细胞后,细胞增殖受抑制,24 h的IC50为0.73 μmol/L,48 h的IC50为0.27μmol/L.免疫荧光法测定6、12、24 h后LC3-Ⅱ水平增高;Western blot法测定LC3-Ⅱ水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间增高;Beclin-1水平增高,磷酸化P70、磷酸化Erk表达降低、磷酸化AKT无明显变化.结论 雷公藤甲素可抑制U251细胞增殖并促进自噬,并可通过上调Beclin-1表达和抑制mTOR的活性来促进自噬.     

慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道研究

目的研究慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道。方法将雄性SD大鼠被随机分为手术组和假手术组,运用激光扫描共聚焦显微镜、Western-blot等方法研究胞浆内咖啡因诱导钙瞬变及钙释放通道RyR2和其调节蛋白FKBP12.6表达的变化。结果慢性心衰大鼠心肌细胞内钙瞬变（ΔF/F0=11.9±0.9）显著低于对照组大鼠心肌细胞内钙瞬变（ΔF/F0=33.2±1.6,P〈0.05）;慢性心衰大鼠心肌细胞内FKBP12.6的表达较对照组下调。结论 FKBP12.6表达下调所致Ca2＋泄漏是导致心衰的原因之一。     

Cyanidin-3-O-Glucoside Ameliorates Palmitic-Acid-Induced Pancreatic Beta Cell Dysfunction by Modulating CHOP-Mediated Endoplasmic Reticulum Stress Pathways

Cyanidin-3-O-glucoside (C3G) is a natural colorant with anti-diabetic properties, while its underlying mechanisms remain far from clear. Here, we investigated the protective role of C3G on palmitic acid (PA)-induced pancreatic beta cell dysfunction and further decipher its possible molecular mechanisms. Both primary isolated mouse islets and the INS-1E cell were used, and treated with a mixture of PA (0.5 mM) and C3G (12.5 µM, 25 µM, 50 µM) for different durations (12, 24, 48 h). We found that C3G could dose-dependently ameliorate beta cell secretory function and further alleviate cell apoptosis. Mechanistically, the primary role of the PKR-like ER kinase (PERK) endoplasmic reticulum (ER) stress pathway was detected by RNA sequencing, and the PERK-pathway-related protein expression, especially the pro-apoptotic marker C/EBP homologous protein (CHOP) expression, was significantly downregulated by C3G treatment. The critical role of CHOP in mediating the protective effect of C3G was further validated by small interfering RNA. Conclusively, C3G could ameliorate PA-induced pancreatic beta cell dysfunction targeting the CHOP-related ER stress pathway, which might be used as a nutritional intervention for the preservation of beta cell dysfunction in type 2 diabetes mellitus.     

小檗碱对压力负荷所致心肌肥厚大鼠的保护作用

目的:通过动物实验探讨小檗碱(Berberine)对压力负荷所致大鼠心肌肥厚模型的保护作用,并探讨其作用机制。方法:通过主动脉缩窄术构建大鼠心肌肥厚模型,将造模成功的16只SD大鼠随机分为模型组及模型+小檗碱组,另外将假结扎主动脉的8只大鼠入组假手术组。术后4周,利用心脏超声测定大鼠的心功能指标;HE、Masson及TUNEL染色等分子生物学方法测定心肌细胞大小、心脏纤维化、心肌细胞凋亡等指标;同时使用RT-q PCR法检测左室心肌组织心房利钠因子(ANP)m RNA的表达;采用Western blot的方法检测内质网应激相关指标Bip/GRP78和CHOP的蛋白表达情况。结果 :与模型组相比,小檗碱可明显改善主动脉缩窄所致的心功能紊乱,显著降低心肌细胞大小(P<0.05)、心脏组织的纤维化程度以及心肌细胞凋亡比率(P<0.05);Western blot结果表明,小檗碱治疗可明显降低长期压力超负荷所致的内质网应激相关指标Bip/GRP78和CHOP的表达的增加(P<0.05)。结论 :小檗碱可显著改善压力超负荷所致的心肌肥厚及心功能紊乱,抑制心肌细胞凋亡,对肥厚型心肌起保护作用,且此种心脏保护性作用可能与其抑制压力负荷所致的内质网应激相关。     

内质网应激相关蛋白与CXCL12蛋白在特发性肺纤维化中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化中的表达及意义.方法 收集荆州市中心医院2004～2014年诊断为特发性肺纤维化且存有活检或手术标本的患者共18例,并收集正常肺组织20例作为对照,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关蛋白(GRP78、CHOP)及CXCL12蛋白(SDF-1)的表达,通过逆转录PCR(RT-PCR)检测肺组织中GRP78 mRNA及CXCL12 mRNA的表达.结果 与对照相比,肺纤维化患者肺泡上皮中GRP78、CHOP、CXCL12蛋白表达均上调,且GRP78 mRNA及CXCL12 mRNA也表达上调.结论 内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化的发病过程中起重要作用,可能参与了特发性肺纤维化的发生与发展.     

内质网应激在UCH-L1抑制剂诱导细胞凋亡中的作用

目的探讨内质网应激(ERS)在泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)抑制剂导致的细胞损伤过程中的作用。方法采用50μmol/L的UCH-L1抑制剂处理人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞。于处理前(对照组)和处理后不同时间点(2、4、6、12、24h),分别采用MTT比色法和Western blotting法检测细胞活力和ERS相关蛋白Bip/Grp78、Xbp-1、p-eIF2α及其促凋亡转录因子CHOP/Gadd153的表达。结果MTT比色法检测发现,50μmol/LUCH-L1抑制剂处理后4h,SK-N-SH细胞活力下降43.1%(P<0.05),且随处理时间的延长继续呈现显著下降趋势(P<0.01)。Western blotting检测显示,经50μmol/LUCH-L1抑制剂处理后,SK-N-SH细胞ERS相关蛋白Bip/Grp78、p-eIF2α和Xbp-1表达分别于处理后2、4、6h时显著增加;转录因子CHOP/Gadd153表达则在处理后2h和4h时略有增加,6h后达到高峰。结论在UCH-L1抑制剂诱导的细胞凋亡过程中,ERS是导致细胞损伤的路径之一。