Nephrin稳定血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞细胞骨架改变的机制研究

 目的：研究足细胞裂孔膜分子nephrin调节血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的足细胞骨架分布改变的分子机制。方法：用AngⅡ及AngⅡ受体拮抗剂氯沙坦或Akt抑制剂LY294002刺激足细胞,FITC-phalloidin染色标记F-actin,分析足细胞骨架运动。Real-time RT-PCR、RT-PCR和Western blotting检测nephrin mRNA和蛋白表达。转染nephrin全长表达质粒（pcDNA3.1-mNPHS1）,建立稳定转染足细胞系,Western blotting检测转染细胞的Akt磷酸化水平,FITC-phalloidin染色分析高表达nephrin对F-actin分布影响。结果：AngⅡ和LY294002刺激后,足细胞的F-actin重组,应力纤维减少,形成F-actin外周环。氯沙坦显著抑制F-actin重排。AngⅡ刺激后nephrin mRNA和蛋白表达显著降低,Akt磷酸化水平降低。pcDNA3.1-mNPHS1转染显著上调足细胞Akt磷酸化水平,促进足细胞短线状足突形成,部分抑制AngⅡ诱导的骨架重排。结论：PI3K/Akt是nephrin和AngⅡ的共同下游通路。Nephrin能通过PI3K/Akt途径部分稳定AngⅡ诱导的足细胞细胞骨架改变。     

五重散对C-BSA肾炎大鼠肾小球足细胞Nephrin mRNA、VEGF mRNA表达的影响

目的:观察五重散对阳离子化牛血清蛋白(C-BSA)肾病大鼠肾小球Nephrin mRNA、VEGFmRNA表达的影响.方法:通过多次腹腔注射C-BSA建立C-BSA肾病大鼠模型,将其随机分成五重散高剂量组(TCM1)、低剂量组(TCM2),雷公藤多甙片组(GTW),模型组,并设空白对照组,每组各7只,观察各组24 h尿蛋白定量、血浆蛋白、血脂、肾小球足细胞Nephrin mRNA、VEGF mRNA表达.结果:五重散能减少C-BSA肾病大鼠蛋白尿,与模型组相比(P＜0.01),能够上调Nephrin mRNA 表达和减少VEGFmRNA表达,降低血脂,升高血浆白蛋白.结论:五重散对C-BSA模型大鼠具有明显的治疗作用,表现为减少蛋白尿,改善血脂状况,恢复足细胞相关蛋白的表达及其分布,逆转足细胞病变.     

1，25-二羟维生素D3对糖尿病肾病患者尿足细胞相关蛋白Nephrin的影响

目的：探讨1,25-二羟维生素D3（1,25-（OH）2D3）对糖尿病肾病（DN）患者尿足细胞相关蛋白Nephrin的影响。方法选取DN患者共40例,根据尿清蛋白排泄率（UAER）水平分为微量清蛋白尿的DN1组22例和大量清蛋白尿的DN2组18例,经6周洗脱期后给予1,25-（O H ）2 D30．25μg/d ,共治疗12周,10例健康体检者为对照组,测定各组人群血钙（Ca2＋）、血磷（P3＋）、血肌酐（Scr）及24 h尿蛋白及VAER ,采用定量酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组观察人群尿液中Nephrin的表达。结果DN组患者尿中Nephrin表达明显多于对照组,DN1组与DN2组间尿中Nephrin表达也存在差异,1,25-（OH）2D3可使DN1组患者尿中Nephrin表达基线下移（P＜0．05）,但对DN2组患者尿中Nephrin表达无明显影响（P＞0．05）。结论尿中Nephrin的表达是预测DN进展的有效因子,1,25-（OH）2D3可减少早期DN患者尿中Nephrin表达从而减少蛋白尿,延缓DN进展。     

血管紧张素Ⅱ灌注诱导nephrin表达改变与足细胞凋亡

目的 研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）灌注对大鼠足细胞裂隙膜分子nephrin表达及足细胞凋亡的影响，以及探讨AngⅡ引起蛋白尿及肾小球硬化的机制。方法 36只雄性Sprague Dawley大鼠分为AngⅡ灌注组(400 ng&#8226;kg-1&#8226;min-1)、生理盐水灌注组和正常对照组，测定28 d内大鼠血压及尿蛋白。分别于14、28 d处死动物取肾，观察组织学改变，并用免疫荧光、免疫电镜检测nephrin分布。RT-PCR及Western印迹法分别检测nephrin mRNA及蛋白表达。TUNEL法检测足细胞凋亡。结果 (1) AngⅡ灌注组大鼠血压升高，14 d达峰值并维持该水平至28 d；AngⅡ灌注7 d即出现蛋白尿，并持续增加。(2) AngⅡ灌注14 d时，足细胞裂隙膜变窄；灌注28 d时，足突增宽及节段性融合，部分足细胞有凋亡小体形成，少数肾小球出现节段性硬化。TUNEL法检测发现足细胞凋亡[（2.7±1.6）个/肾小球切面]，凋亡数与蛋白尿量呈正相关（r = 0.86，P < 0.01）。(3) AngⅡ灌注14 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达上调（P < 0.05）。nephrin由正常的沿毛细血管袢线状分布向粗颗粒、团块状分布模式转变。AngⅡ灌注28 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达下降（P < 0.05），且nephrin蛋白表达与足细胞凋亡数呈负相关（r = －0.63，P < 0.01）。 结论 AngⅡ灌注诱导的nephrin表达及分布改变可能导致了足细胞凋亡及肾小球硬化的发生与发展。     

Nephrin在糖尿病肾病中的表达及意义

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（DM）严重并发症之一,是DM病人死亡的主要原因。据美国糖尿病协会统计,DN已成为欧美等国家致终末期肾病的最主要原因,而蛋白尿是DN早期临床标志,蛋白尿的发生主要取决于肾小球滤过功能。     

Urinary podocalyxin and nephrin levels as biomarkers in lupus nephritis patients: Relation to renal involvement and disease activity

Aim of the workTo evaluate the impact of systemic lupus erythematosus (SLE) on urinary levels of podocalyxin and nephrin and to determine their relationship to renal biopsy and disease activity in lupus nephritis (LN) patients.Patients and methodsThe study included 50 LN patients with their renal biopsy classified according to the international society of nephrology. Disease activity was determined using the British Isles Lupus Assessment Group (BILAG). All patients underwent clinical and laboratory evaluation. Urine samples were collected for the assessment of urinary podocalyxin (UPx) and nephrin (UN) by ELISA and for the estimation of protein (UP) and creatinine (Cr) concentrations. The UPx:Cr, UN:Cr and UP:Cr ratios were calculated.ResultsUrinary levels of podocalyxin (593.8 ± 282.2 ng/ml), nephrin (304.1 ± 236.8 ng/ml) and protein (2.36 ± 0.56 g/l) were significantly higher, while urinary creatinine levels (101.4 ± 28.7 mg/l) lower in LN patients compared to control (38.1 ± 9 ng/ml, 19.2 ± 4.1 ng/ml, 0.34 ± 0.13 g/l and 155.4 ± 26.7 mg/l; p = 0.0008, p = 0.0003, p = 0.00002 and 0.0009, respectively). Consequently, UNCr, UPxCr and UPCr ratios were significantly higher in patients compared to control. There was a significant correlation of the estimated ratios with the LN class and with the BILAG scores being most significant with UPx:Cr ratio. ROC curve and regression analyses defined UPx:Cr ratio as the specific significant predictor of pathological LN grade.ConclusionSLE deleteriously affects fine glomerular structure as reflected by increased urinary levels of podocyte-related proteins; podocalyxin and nephrin. Urinary podocalyxin/creatinine ratio significantly predicts the pathological impact of SLE on the kidney and could be used as a non-invasive marker for such effect and its progression.     

蛋白尿慢性肾纤维化大鼠肾组织Nephrin蛋白表达动态变化

目的检测蛋白尿多柔比星肾损伤大鼠足细胞相对数目及Nephrin的表达变化,探讨Nephrin表达变化在蛋白尿发生发展中的意义。方法 36只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=16)和模型组(n=20),应用多柔比星(4 mg/kg)尾静脉注射、一周末后重复的方法建立大鼠蛋白尿慢性肾纤维化模型,于第1次注射多柔比星后4、7、10、13周末收集标本,观察大鼠24 h尿蛋白、血生化指标等,光镜、电镜观察肾组织的病理改变,Western blot检测大鼠肾皮质中Nephrin蛋白的表达,免疫组化观察Wilm肿瘤蛋白1(WT1)表达。结果①第4周末开始,模型组大鼠蛋白尿显著高于对照组(P<0.01)。②肾脏病理在第7周末时出现局灶肾小球硬化,第13周末肾小球呈明显硬化表现,第10周末见足细胞脱离基底膜。③肾皮质WTl蛋白的表达量逐渐减少,但肾脏Nephrin蛋白表达4周末时较对照组增加(P<0.01),7周末后逐渐降低。结论足细胞相对密度及相对数量的减少可能是蛋白尿发生、发展的重要因素,病程中Nephrin蛋白表达量呈先升后降的变化趋势,疾病早期其表达增加可能是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应。     

血管紧张素Ⅱ对足细胞nephrin 磷酸化水平的影响

目的 通过建立血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)输注大鼠模型及体外足细胞培养,观察AngⅡ刺激对足细胞nephrin磷酸化水平的影响.方法 30只SPF级Wistar大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为AngⅡ组(AngⅡ400 ng· kg-1·min-1,n=12)、替米沙坦(Tel)组(AngⅡ+Tel 3 mg· kg-1·d-1,n=12)和正常对照组(生理盐水代替AngⅡ,n=6),于实验0、7、14、21、28 d测量大鼠尾动脉收缩压,收集24 h尿液,检测尿白蛋白.分别在14、28 d处死动物,收集血液标本,检测血肌酐;收集肾脏标本,透射电镜观察肾小球足细胞形态,放免法检测血浆及肾组织AngⅡ水平;Western印迹检测nephrin表达及其磷酸化水平.体外培养小鼠永生化足细胞,AngⅡ (10-6 mol/L)刺激不同时间,并行洛沙坦(10-5 mol/L)干预,Western印迹法检测足细胞nephrin 表达及其磷酸化水平.异硫氰酸荧光素( FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞F-actin,用外周F-actin环评分系统(CFS)半定量分析足细胞骨架运动.结果 (1)与正常对照组同时间点相比,AngⅡ组大鼠自7d起尾动脉收缩压开始升高(P＜0.05),随着作用时间的延长,血压持续升高.AngⅡ输注7d大鼠开始出现蛋白尿,并持续增加.各组大鼠血肌酐、尿肌酐及内生肌酐清除率无明显变化.AngⅡ输注大鼠血浆及肾组织AngⅡ浓度明显增高(均P＜0.05).(2)与正常对照组相比,AngⅡ输注组大鼠肾小球足细胞nephrin表达明显减少,其磷酸化水平亦显著下降(P＜0.05).(3)与正常对照组相比,AngⅡ刺激早期(3～6 h),足细胞nephrin磷酸化表达即明显下调(P＜0.05),刺激12～24 h维持低水平表达.(4)AngⅡ刺激后,F-actin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分显著高于正常对照组(P＜0.05).结论 正常状态下足细胞nephrin维持一定水平磷酸化状态,AngⅡ可以诱导足细胞nephrin磷酸化水平下调.nephrin磷酸化水平改变可能是AngⅡ诱导足细胞骨架重排、足突融合的重要分子机制.     

厄贝沙坦对早期糖尿病肾脏疾病大鼠足细胞nephrin和podocin表达的影响

目的：观察厄贝沙坦（irbesartan）对糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）大鼠足细胞裂孔隔膜蛋白分子（nephrin和 podocin）表达的影响,探讨厄贝沙坦对DKD的防治作用。方法以高脂高糖喂养8周联合小剂量链脲佐菌素（30 mg/kg）建立DKD大鼠模型,将 DKD大鼠模型随机分为2组：厄贝沙坦组及模型对照组;另设正常对照组。厄贝沙坦组给予厄旦沙坦（50 mg·kg-1·d-1）,另外2组每日给予等量0.9%生理盐水灌胃。各组于治疗前及药物干预后第4、8、12周周末检测大鼠血糖浓度和尿微量白蛋白量;观察大鼠体质量、肾重、肾肥大指数、血清尿素氮、肌酐、总胆固醇、三酰甘油变化;光镜观察肾脏病理改变;应用免疫组化技术观察足细胞相关蛋白 nephrin、podocin肾组织分布与表达;采用 Western blot技术测定肾皮质 nephrin、podocin 蛋白的表达。结果应用厄贝沙坦干预后与DKD对照组相比,大鼠的尿微量白蛋白总量、肾肥大指数、血糖、尿素氮、血肌酐较模型对照组明显降低（P〈0.05）,体质量增加（P〈0.05）,病理改变减轻,nephrin和 podocin蛋白表达增加（P〈0.05）。结论厄贝沙坦能上调 nephrin和 podocin的表达水平,降低尿微量白蛋白排泄,延缓DKD的进展。     

Nephrin 与肾小球滤过膜

Nephrin是近年来在肾小球足突裂孔膜发现的第一个跨膜糖蛋白,为粘附分子类的免疫球蛋白超家族成员,可能具有细胞间粘附作用、信号传导功能及促进足细胞与足突裂孔膜发育成熟的作用.在先天性与获得性肾病存在其基因异常或mRNA表达的变化及其分布位置的改变,结果使滤过膜形态结构与屏障功能完整性破坏,导致大量蛋白尿产生.Nephrin的发现为蛋白尿病理机制的研究提供了崭新的途径,为的基因治疗带来了希望.