绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的影响及机制

目的:研究绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏足细胞相关分子(nephrin)、血管通透因子(VEGF)mRNA表达的影响,探讨其降低尿蛋白、保护肾脏的机制。方法:采用单侧肾切除加链脲佐菌素(STZ)注射法改良复制DN模型,实验分为正常组、模型组、治疗组(绞股蓝总皂苷高、中、低剂量组)和缬沙坦组。干预4周后电镜观察肾小球超微结构改变,RT-PCR检测nephrin、VEGF mRNA表达。结果:各治疗组病理变化较模型组均有不同程度改善:足突增宽或部分融合,基底膜增厚减轻,同时nephrin mRNA表达水平较模型组明显上调(P0.01),VEGF表达明显抑制(P0.01),其中高剂量组和缬沙坦组效果类似,明显优于低剂量组(P0.01)。结论:绞股蓝总皂苷可能通过上调足细胞相关分子nephrin表达,抑制分泌VEGF过表达,减轻足细胞超微结构改变,从而保护足细胞,降低尿蛋白,延缓肾小球硬化。     

复肾功方对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏nephrin mRNA表达的影响

目的 研究复肾功方对慢性肾功能衰竭（chronic renal failure,CRF）大鼠肾组织足细胞裂孔隔膜蛋白（nephrin） mRNA表达的影响,探讨其降低尿蛋白、减轻肾损害的作用机制。方法 将55只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,复肾功方低、中、高剂量组,每组11只。正常组常规饲养,其余4组大鼠食用含腺嘌呤饲料建立慢性肾功能衰竭模型,连续喂养21 d。造模成功后,所有大鼠改用常规饲料。正常组和模型组按20 mL/(kg·d)灌胃给予生理盐水;复肾功方低、中、高剂量组按大鼠体质量分别以生药4、8、16 g/kg灌胃复肾功方,1次/d,连续灌胃30 d。实验结束后,收集大鼠尿液测定24 h尿蛋白定量,检测各组大鼠血清血肌酐(SCr)和尿素氮（BUN）水平,HE染色检测肾小球组织形态学改变,免疫荧光检测nephrin蛋白表达,Real-Time PCR法观察肾脏nephrin mRNA表达情况。结果 与正常组比较,模型组24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平升高(P<0.05),nephrin蛋白及mRNA表达下降（P<0.05);与模型组比较,经复肾功方治疗后,24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平降低（P<0.05）,肾组织nephrin蛋白及mRNA的表达升高（P<0.05）。结论 复肾功方降低CRF大鼠尿蛋白,减轻肾损害程度,其机制可能与升高肾组织nephrin蛋白及mRNA的表达、减轻足细胞损伤有关。     

阿霉素肾病大鼠中肾小球nephrin表达与氧化应激反应的关系

目的：氧化和抗氧化失衡可能是肾病综合征产生大量蛋白尿的原因之一,而肾小球裂隙膜分子nephrin在维持肾小球滤过屏障功能中起着重要作用。因此该实验初步探讨阿霉素肾病大鼠肾小球裂隙膜分子nephrin表达与氧化应激反应的关系,以及泼尼松和维生素E对阿霉素大鼠肾损伤保护作用的机制。方法：尾静脉单次注射阿霉素5 mg/kg建立肾病发病过程中的氧化应激模型,并增加泼尼松和维生素E干预。应用化学比色法检测肾皮质氧化应激指标变化,应用免疫组织化学技术观察肾小球裂隙膜分子nephrin表达变化,并对两者进行相关性分析。结果：①肾病组大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量及24 h尿蛋白排泄量高于正常对照组,超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）活性低于正常对照组。与肾病组相比,泼尼松和维生素E干预组从14 d开始尿蛋白排泄量明显减少,直到28 d（P<0.05）。维生素E干预组肾皮质MDA含量较肾病28 d组下降,SOD、T-AOC活性较肾病28 d组升高。②正常对照组大鼠nephrin沿肾小球基底膜呈深褐色连续线性分布;肾病组随时间的延长深褐色连续线性分布向浅褐色短线条状或点状分布转化;泼尼松和维生素E干预组减轻了nephrin分子的异常改变;量化分析显示,肾病组肾小球nephrin阳性表达含量明显低于正常对照组,泼尼松及维生素E干预组肾小球nephrin阳性表达含量较肾病组增加。③肾小球nephrin蛋白阳性表达含量与肾皮质MDA含量呈负相关,与肾皮质SOD和T-AOC活性呈正相关。结论：肾小球裂隙膜分子nephrin表达减少与氧化应激反应密切相关;泼尼松和维生素E对阿霉素肾病大鼠肾损伤有保护作用。［中国当代儿科杂志,2009,11（1）：56-60］     

骨髓间充质干细胞移植对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠足细胞修复作用的研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)肾病大鼠足细胞修复作用及其对裂孔隔膜分子Nephrin表达的影响,为BMSCs移植治疗肾病综合征提供实验依据。方法：45只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为 3组,每组15只。模型组：一次性腹腔注射PAN（0.15 mg/g）造模;BMSCs组：PAN造模+BMSCs移植（细胞移植前经Brdu标记示踪）;对照组：不予以造模。实验第10天杀鼠,留取标本行血、尿、肾组织超微结构检测,免疫组化检测肾脏Brdu标记阳性细胞的表达,半定量RT-PCR及Western blot方法检测Nephrin 表达变化。结果：模型组大鼠出现大量蛋白尿、血白蛋白降低、胆固醇升高,伴有广泛足突的融合。与模型组比较,BMSCs组尿蛋白、血胆固醇降低,血白蛋白回升及足突融合现象改善,差异有统计学意义（P＜0.05）;免疫组化显示,BMSCs组肾组织中可见阳性细胞,模型组及对照组未见阳性细胞;半定量RT-PCR及Western blot显示,模型组Nephrin相对表达量较对照组明显下降,BMSCS组与模型组比较有所增加,差异有统计学意义（P＜0.05)。结论：BMSCs移植对PAN肾病大鼠足突融合有一定的改善,Nephrin表达的变化可能在其中发挥了作用。［中国当代儿科杂志,2010,12（6）：483-487］     

基于疾病归经理论的一半汤对IgA肾病大鼠蛋白尿及Nephrin、CD2AP表达的影响

目的观察一半汤对IgA肾病(IgAN)大鼠蛋白尿及Nephrin、CD2AP表达的影响。方法将56只SPF级Wistar雄性大鼠随机抽取10只作空白组,其余46只造模。采用牛血清白蛋白(BSA)+四氯化碳(CCl4)+脂多糖(LPS)的方法建立IgAN大鼠模型,持续12周,将造模完成后所剩的40只大鼠随机分为模型组、肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组,每组各10只。肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组分别给予肾炎康复片、二半汤、一半汤灌胃,持续8周。分别于造模第12周,治疗第4,6,8周末测24h尿蛋白定量(24h-UPr),尿常规。治疗第8周末处死大鼠心脏取血,检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN),取大鼠肾皮质检测Nephrin、CD2APmRNA及相关蛋白的表达。结果造模完成后,模型组24h-UPr和尿红细胞计数较空白组显著增多(P0.05);治疗完成后,肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组24h-Upr较模型组显著降低(P0.05),一半汤组较肾炎康复片组显著降低(P0.05);肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组之间红细胞计数无统计学差异(P0.05);肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组SCr,BUN较模型组显著降低(P0.05),一半汤组较肾炎康复片组显著降低(P0.05)。肾炎康复片组、二半汤组、一半汤组Nephrin、CD2APmRNA及相关蛋白的表达较模型组显著降低(P0.05),一半汤组较肾炎康复片组显著降低(P0.05)。结论一半汤能降低尿蛋白,保护肾功能,其作用可能与调节Nephrin、CD2AP的表达有关,且疗效较二半汤进一步提高。     

大鼠足细胞的原代培养及其Nephrin的特异表达

目的 建立简便的大鼠足细胞原代培养体系,检测其去氧肾上腺素(Nephrin) mRNA及蛋白的表达水平.方法 无菌取肾,分离肾皮质,胶原酶消化法分离肾小球,培养9～10d,胰蛋白酶差异消化法传代,过筛去除肾小球继续培养5～7 d:形态学观察和间接免疫荧光法进行足细胞鉴定;流式细胞仪分析足细胞纯度;实时定量PCR(qRT-PCR)、间接免疫荧光法和Western blot法比较前三代足细胞中Nephrin mRNA及蛋白的表达水平.结果 接种5d后大部分肾小球贴壁,肾小球周围有细胞爬出,其最外缘有树枝状细胞分布,形态学及特异性抗体Nephrin、WT-1鉴定为足细胞;流式细胞仪分析足细胞纯度为94.7％;间接免疫荧光和qRT-PCR均显示:与第二、三代足细胞相比,第一代足细胞中Nephrin mRNA和蛋白表达均较高(均P＜0.05);Western blot示体外培养大鼠足细胞表达两种分子量的Nephrin,且第一代足细胞Nephrin灰度值高于第二、三代足细胞(P＜0.05).结论 酶消化法结合差异过筛法接种可促进肾小球贴壁,有利于培养纯度高的足细胞;大鼠足细胞体外培养条件下能特异性表达Nephrin结构及功能蛋白.     

厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏足细胞保护作用的研究

目的探讨厄贝沙坦对糖尿病大鼠尿蛋白以及足细胞、足突顶膜区主要的带负电荷跨膜蛋白Podocalyxin的影响。方法采用链脲佐菌素(streptozotocin STZ,65mg/kg)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。将30只雄性SD大鼠随机分为3组:正常组、糖尿病模型组和厄贝沙坦(ARB)治疗组。连续监测血糖8周,8周后处死各组大鼠的前一天行24小时尿蛋白定量和肾功检查了肾组织;处死大鼠后取行苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin stain,HE)观察其病理变化;透射电镜观察足细胞、裂孔隔膜等变化。采用Western蛋白印迹从蛋白水平观察nephrin蛋白水平的表达。结果模型组大鼠镜下见肾小球体积增大,基底膜增厚(P<0.05)及系膜物质增多,足细胞与正常对照组比较明显减少(P<0.01),肾小球内可见散在炎细胞浸润。部分毛细血管腔受压变窄,部分肾小管上皮细胞胞浆疏松,轻度水肿。治疗组与模型组分别比较,肾小球基底膜未见明显增宽,足细胞数明显增加(P<0.05)。模型组大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐水平明显升高,与对照组相比差异显著(P<0.05)。治疗组与模型组相比,上述生化指标均有所改善(P<0.05)。West-ern蛋白印迹结果表明,与正常组相比,模型组nephrin蛋白水平明显下降,经过厄贝沙坦干预后nephrin表达明显上调。结论厄贝沙坦能改善糖尿病肾病大鼠足细胞及肾脏的病理损害,显著减少糖尿病大鼠24h尿蛋白,上调nephrin的表达,具有一定的肾保护作用。     

阿霉素肾病大鼠肾皮质nephrinmRNA的表达及来氟米特对其表达的影响

目的：观察阿霉素肾病大鼠肾皮质nephrin mRNA的表达及来氟米特对其表达的影响，探讨nephrin在蛋白尿发生发展中的作用以及来氟米特治疗肾脏病的可能机制。方法：建立阿霉素肾病模型，第4周进一步将模型组分为治疗组和非治疗组，治疗组给予来氟米特管饲。应用光镜、电镜观察不同时期（第2、4、6、8周）各组大鼠肾组织的病理改变；BCA法检测尿蛋白排泄量；半定量RT—PCR的方法检测肾皮质中nephrin mRNA的表达。结果：（1）模型组尿蛋白量逐渐增加，而治疗组第6周和第8周的尿蛋白量均低于同时期的非治疗组水平（P=0．02和P＜0．01）；（2）模型组nephrin mRNA表达量在2、4、6、8周分别为对照组的0．5、1．0、2．0、1．6倍，并与尿蛋白量呈正相关（r=0．699，P＜0．001）；（3）模型治疗组nephrin mRNA的表达第8周达非治疗组的1．3倍。结论：（1）随着阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄量的增加，肾皮质nephrin mRNA的表达发生了显著变化，并与蛋白尿的发生发展之间具有一定的相关性；（2）来氟米特可减少肾病大鼠尿蛋白量，同时增加肾皮质nephrin mRNA的表达。     

血管紧张素Ⅱ灌注诱导nephrin表达改变与足细胞凋亡

目的 研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）灌注对大鼠足细胞裂隙膜分子nephrin表达及足细胞凋亡的影响，以及探讨AngⅡ引起蛋白尿及肾小球硬化的机制。方法 36只雄性Sprague Dawley大鼠分为AngⅡ灌注组(400 ng&#8226;kg-1&#8226;min-1)、生理盐水灌注组和正常对照组，测定28 d内大鼠血压及尿蛋白。分别于14、28 d处死动物取肾，观察组织学改变，并用免疫荧光、免疫电镜检测nephrin分布。RT-PCR及Western印迹法分别检测nephrin mRNA及蛋白表达。TUNEL法检测足细胞凋亡。结果 (1) AngⅡ灌注组大鼠血压升高，14 d达峰值并维持该水平至28 d；AngⅡ灌注7 d即出现蛋白尿，并持续增加。(2) AngⅡ灌注14 d时，足细胞裂隙膜变窄；灌注28 d时，足突增宽及节段性融合，部分足细胞有凋亡小体形成，少数肾小球出现节段性硬化。TUNEL法检测发现足细胞凋亡[（2.7±1.6）个/肾小球切面]，凋亡数与蛋白尿量呈正相关（r = 0.86，P < 0.01）。(3) AngⅡ灌注14 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达上调（P < 0.05）。nephrin由正常的沿毛细血管袢线状分布向粗颗粒、团块状分布模式转变。AngⅡ灌注28 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达下降（P < 0.05），且nephrin蛋白表达与足细胞凋亡数呈负相关（r = －0.63，P < 0.01）。 结论 AngⅡ灌注诱导的nephrin表达及分布改变可能导致了足细胞凋亡及肾小球硬化的发生与发展。