生长激素对促性腺激素释放激素拟似物处理后的青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和表型的影响

目的研究生长激素（GH）对促性腺激素释放激素拟似物（GnRHa）处理后的离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和表型的影响。方法采用两步酶消化法分离培养经GnRHa处理后的5～8只雌鼠胫骨生长板软骨细胞,用四氮甲基唑蓝（MTT）、流式细胞仪测定细胞周期以及免疫组化法测定增殖细胞核抗原（PCNA）和胶原Ⅱ（ColⅡ）的表达,观察不同作用时间和不同剂量的GH对软骨细胞增殖和表型的影响。结果 GH能促进体外培养GnRHa处理后的青春期大鼠生长板软骨细胞的增殖,并存在一定的时效和量效关系。GH作用后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天组与对照组比较有统计学意义（P〈0.05）,并以第4天时的促增殖效应最强。GH浓度低时（10ng/ml,20ng/ml）促增殖效应不明显（P〉0.05）,而浓度增加至50ng/ml时促增殖效应开始显现（P〈0.05）,至100ng/ml时促增殖效应最明显。GH亦能促进ColⅡ的表达,以GH作用后第4天,浓度为100ng/ml时ColⅡ的表达最强。结论 GH能以直接作用的方式促进体外培养的经GnRHa处理后的大鼠胫骨生长板软骨细胞的增殖和ColⅡ的表达,GH促增殖的剂量与临床应用剂量存在一致性,为GH克服GnRHa使用过程中所造成的生长减速提供了实验理论依据。     

几丁糖作为软骨细胞培养支架的实验研究

目的：探讨几丁糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法：采用几丁糖无纺网作为细胞培养支架,使用前首先用10%多聚赖氨酸包埋以增加其对软骨细胞的吸附性,然后把几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起体外培养10d,软骨细胞数目增加约6倍,并且与几丁糖支架牢固结合不易丢失。结论：几个糖无纺网经10%多聚赖氨酸包埋后,对软骨细胞吸附性增强,并且几丁糖具有良好的生物学特性,因此几丁糖符合组织工程对细胞培养支架的要求。有可能成为组织工程中一种良好的细胞培养支架。     

Tissue engineered cartilage: utilization of autologous serum and serum-free media for chondrocyte culture

BACKGROUND: Standard culture medium contains bovine serum. If standard culture methodology is used for future human tissue-engineering, unknown risks of infection from bovine disease or immune reaction to foreign proteins theoretically might occur. In this study we wished to evaluate the potential of chondrocyte expansion using autologous and serum free media. METHODS: Autologous auricular cartilage was harvested in a swine model. An initial concentration of 100x10(3) cells per group were expanded in three groups. Group A, F-12 with 10% fetal calf serum; Group B, F-12 supplemented with 10% autologous serum; Group C, F-12 supplemented with growth factors. Cell numbers were counted at days 3, 6, 9 and 12. RESULTS: The cells in all the three groups exhibited normal chondrocyte morphology. At early time points there was a statistically significant difference in the number of cells between Group A and the two other groups (p<0.05). By day 12, both Groups A and C demonstrated greater cell number as compared to Group B (p<0.05). CONCLUSION: The results suggest that both autologous serum as well as serum free media might be substituted for the expansion of the number of chondrocytes, thus avoiding the potential need for a bovine serum supplement.     

Cell Density-Dependent Proliferative Effects of Transforming Growth Factor (TGF)-β1, β2, and β3 in Human Chondrosarcoma Cells HCS-2/8 Are Associated with Changes in the Expression of TGF-β Receptor Type I

In this study, the growth properties of the human chondrosarcoma cell line HCS- 2/8, its response to transforming growth factor (TGF)-β isoforms 1, 2, and 3, and its expression of TGF-β receptors I and II were examined. We demonstrated that these tumor cells are not contact-inhibited and that they can proliferate in the absence of additional serum growth factors. In sparse cultures, all TGF-β forms inhibited the growth of HCS-2/8 cells, whereas they induced a 2-fold increase of DNA synthesis in serum-fed confluent cultures. In serum-free confluent conditions only TGF-β1 stimulated the proliferation rate, whereas TGF-β2 was without effect and TGF-β3 was rather inhibitory. This bimodal effect of TGF-β forms was associated with a greater level of TGF-β receptor I mRNA in confluent HCS-2/8 than in sparse cultures, suggesting that the growth response to TGF-β forms is dependent on the receptor profile expressed.     

白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖影响的实验研究

目的：观察中药白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖的影响。方法：取1月龄的SD大鼠膝关节关节软骨Ⅱ型胶原酶消化,建立软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色鉴定后,取体外培养第3代软骨细胞随机分为6组,分别加入不同浓度空白血清（5％、10％、15％）,不同浓度白附片含药血清（5％、10％、15％）,继续培养24、48、72h后,采用MTT比色法检测软骨细胞增殖的变化。结果：白附片含药血清组吸光度值（OD值）显著高于空白血清组,两组比较,差异有非常显著性意义（P＜0．01）。结论：白附片含药血清能有效促进大鼠膝关节软骨细胞的增殖。     

脱氢表雄酮对白细胞介素-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞退变的影响

目的:研究脱氢表雄酮(DHEA)对白细胞介素(IL-1β)诱导的人骨关节炎软骨细胞退变的影响。方法:分离人骨关节炎软骨细胞传代培养并加入IL-1β,分别将50,25和12.5μmol/L的DHEA作用于该软骨细胞。其后检测细胞增殖、上清液糖胺聚糖(GAG)和NO含量、细胞凋亡以及质金属蛋白酶-1及其组织抑制剂-1(MMP-1和TIMP-1)含量。结果:50,25和12.5μmol/L的DHEA均能促进软骨细胞增殖和GAG合成(均P<0.01),抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡(均P<0.01)以及MMP-1合成(均P<0.01);50和25μmol/L的DHEA可抑制IL-1β诱导的软骨细胞NO形成(均P<0.01),还可抑制软骨细胞自身的凋亡(均P<0.01)和MMP-1合成(均P<0.05),其效应呈浓度依赖性;50μmol/L的DHEA还可改善IL-1β对骨关节炎软骨细胞TIMP-1合成的抑制作用(P<0.05)。结论:脱氢表雄酮能在一定程度上对抗IL-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞退变。     

骨关节炎中软骨细胞的CD80/CD86的表达及白细胞介素18对其影响

目的探讨软骨细胞及γ-干扰素(γ-IFN)在骨关节炎发病中的作用。方法收集10例膝关节骨关节炎患者软骨标本为病例组,同时收集8例股骨颈骨折患者软骨标本为正常对照组。经过软骨细胞培养及γ-IFN的刺激,采用流式细胞技术检测CD80/CD86的表达情况。结果病例组软骨细胞表达CD80的阳性细胞百分率(2.47%±0.59%)比正常对照组软骨细胞(0.94%±0.25%)高(P<0.01)。病例组软骨细胞表达CD86的阳性细胞百分率(1.71%±0.71%)比正常对照组软骨细胞(0.93%±0.47%)高(P<0.01)。正常对照组软骨细胞在γ-IFN刺激后CD80阳性百分率(7.39%±3.18%)比刺激前明显增高(P<0.01),CD86阳性百分率刺激后(4.96%±3.11%)明显升高(P<0.01)。OA组软骨细胞在γ-IFN刺激后CD80和CD86阳性百分率(7.54%±4.47%、6.52%±4.24%)比刺激前明显增高(P<0.01)。两组软骨细胞在γ-IFN刺激后CD80和CD86的表达差异均没有显著性。结论正常软骨细胞有抗原提呈的潜能,γ-IFN可以诱导正常软骨细胞表达CD80/CD86增加,γ-IFN在骨关节炎发病中可能发挥致炎因子的作用。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

兔羊膜上皮细胞向兔软骨细胞诱导的研究

目的 观察兔羊膜上皮细胞(AECs)向兔软骨细胞诱导分化的特性.方法 获得兔新鲜羊膜组织,去除外膜组织,并剪碎,胶原酶消化法进行原代培养.经传代培养、细胞形态观察后,用软骨细胞诱导培养液使AECs向软骨细胞分化,并以组织化学和免疫组织化学染色进行鉴定,电镜观察细胞形态检测软骨细胞特征性表现、细胞活性噻唑蓝(MTT)比色法检测.结果 兔羊膜上皮细胞具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能,采用酶消化法可快速分离培养原代细胞.MTT比色法显示第3代传代细胞活性、增殖能力较高,未进行软骨细胞诱导的细胞未显示出软骨细胞的特征性表现,经软骨细胞诱导分化后,组织化学和免疫组织化学检测表明其能较好的表现软骨细胞特征.结论 兔AECs无伦理学限制,且具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能,有望成为软骨细胞组织工程学新型的种子细胞.     

正钒酸钠对椎间盘软骨细胞功能的抑制作用

目的探讨正钒酸钠（Sodium Orthovanadate,Na3VO4）对椎间盘软骨终板软骨细胞的作用。方法使用酶消化法培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞,以10、20及30umol／L不同浓度Na3VO4干预第三代软骨细胞。培养7d后,用MTT法检测软骨细胞增殖率,RT-PCR检测Ⅱ型、Ⅸ型胶原和蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA的表达,定量RT—PCR检测PTPN1、IGFRmRNA的表达。结果与对照组比较：（1）10umol／L Na3VO4组上述各项检测指标变化不明显,差异无统计学意义;（2）20及30umol／L Na3VO4组软骨细胞增殖率下降（q=31．51,81．42,P〈0．01）、Aggrecan（q=52．09,102．55,P〈0．01）和PTPN1（q=7．67,4．74,P〈0．01）mRNA表达降低;（3）30umol／L Na3VO4组Ⅱ型胶原（q=51．46,P〈0．01）、Ⅸ型胶原（q=8．62,P〈0．01）mRNA表达降低;（4）各浓度Na3VO4组IGFRmRNA均增加（q=13．96,7．67,4．74,P〈0．01）。结论20及30umol／L Na3VO4可抑制椎间盘软骨细胞增殖,降低Ⅱ、Ⅸ型胶原、Aggrecan以及PTPN1的mRNA表达,说明Na3VO4对软骨细胞中PTPs的活性有抑制作用,从而降低了软骨细胞生物学功能。但Na3Vo4对IGFR mRNA无抑制作用,并可能有一定的促表达作用。