氧化低密度脂蛋白诱导心肌细胞LOX-1表达的研究

目的探讨氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对心肌细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）表达的影响。方法原代培养乳鼠心肌细胞,分别用不同浓度的ox-LDL（0,10,20,50,100μg/ml）与心肌细胞作用不同时间（0,6,12,24,36h）。用RT-PCR测定LOX-1mRNA表达水平,Western blot测定LOX-1蛋白表达水平。结果不同浓度的ox-LDL均可诱导心肌细胞LOX-1mRNA和蛋白表达,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）,在10-50μg/ml的剂量范围内存在明显的剂量-效应关系,各组间比较有显著性差异（P〈0.05）。随着ox-LDL与心肌细胞作用时间的延长,心肌细胞LOX-1mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异具有显著性（P〈0.05）,在6～24h内呈明显的时间-效应关系,各组间比较有显著性差异（P〈0.05）。结论 ox-LDL可诱导心肌细胞LOX-1表达,并在一定范围内随ox-LDL浓度增加和作用时间延长而表达增强。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展

骨髓中至少存在两种干细胞：造血干细胞（Hemopoieticstemcells,HSCs）ffx＇f~充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）。以前认为MSCs的重要作用是支持造血,近来的研究发现MSCs具有自我更新和多向分化的潜能。缺血性心脏病因其功能性心肌细胞减少而发生心室重构,最终导致心力衰竭,严重威胁着人类的身体健康。MSCs在体外或体内可诱导分化为心肌样细胞,并应用于缺血性心脏病的治疗,通过减少梗死面积,改善心肌功能,为心脏病的治疗提供了新途径。骨髓间充质干细胞的来源广泛,取材方便,较易培养已成为研究的热点。     

小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞过程中基因表达情况和电生理特性研究

目的： 探讨小鼠胚胎干细胞在体外分化心肌样细胞过程中αMHC、Anf、MLC2v基因的表达情况以及分化的心肌样细胞的电生理特点。 方法： 将转染PαMHC-EGFP小鼠D3胚胎干细胞系,体外诱导分化心肌样细胞，应用RT-PCR检测0 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d拟胚体（EB）细胞中αMHC、Anf、 MLC2v基因的表达情况，同时应用膜片钳技术，观察心肌样细胞的电生理特性。 结果： 在EB形成的7d和8d可见EB内出现有绿色荧光蛋白表达的心肌样细胞群；RT-PCR结果显示αMHC基因表达在EB体形成第7 d，而在10 d、14 d跳动的心肌样细胞中该基因表达增强（P<0.05），而Anf、 MLC2v基因的表达仅出现在心肌样细胞；膜片钳记录的心肌样细胞动作电位显示,73.5%（n=34）的细胞记录到典型心房肌细胞动作电位［APD90=（78.4±3.1）ms］；20.5%细胞表现为起搏细胞动作电位［APD90=（112.6±5.5）ms］；1个细胞显示了典型的心室肌细胞动作电位的特征（APD90=200 ms）。 结论： 在心肌样细胞分化的早期可见αMHC、Anf、 MLC2v基因的表达，这3种基因可为心肌发育过程中的特征性基因并对心肌发育起调节作用。而此干细胞系分化的心肌样细胞主要为心房肌细胞和起搏细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的:培养人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cell,hMSCs),探讨hMSCs体外向心肌细胞(Cardio-myocytes,CM)定向诱导分化的实验研究。方法:取人的骨髓血,用Percoll(1.073g/ml)密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法体外培养扩增hMSCs,并进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组。选用生长良好、纯度达到95%的P5代hMSCs,用不同诱导浓度的5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)1、5、10和20μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponinⅠ及Desmin的免疫组化鉴定。结果:体外分离纯化培养扩增出hMSCs,其CD44阳性率平均为93.26%±2.48%,与平行对照组(3.42%±1.09%)相比有明显差异(P<0.01)。经5和10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs表达心肌特异性标记TroponinⅠ、Desmin;10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs阳性率明显高于5μmol/L组;在20μmol/L组中,诱导后超过50%的细胞脱落死亡。结论:hMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10μmol/L。     

参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响

目的：观察参麦注射液对急性缺氧-复氧后心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。 方法： 采用原代培养的大鼠心肌细胞，通过化学缺氧法使细胞缺氧5 min，再恢复氧供应15 min，复制心肌细胞缺氧-复氧（anoxia-reoxygenation, A/R）模型。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡百分率；Fluo-3负载激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子水平。 结果： A/R组心肌细胞凋亡百分率明显高于正常组，细胞内平均钙离子荧光强度也显著强于正常组（P<0.01）。参麦注射液组细胞凋亡率显著小于A/R组，同时细胞内钙超载也明显轻于A/R组（P<0.01）。 结论： 参麦注射液能有效抑制缺氧-复氧心肌细胞的凋亡，这种保护作用的机制之一可能是通过减轻细胞内Ca2+超负荷实现的。     

高功率脉冲微波和电磁脉冲辐照对心肌细胞膜电穿孔效应及机理的研究

电磁辐射可造成人体多器官系统的损伤。对其损伤的病理机制至今尚未完全阐明。心脏是电磁辐射损伤的敏感器官之一。本实验拟通过研究HPPM和EMP对心肌细胞的影响,探讨电磁辐射致伤的关键机制,解释脉冲电磁场致心肌细胞损伤的发展规律。本实验采用HPPM和EMP辐照原代培养心肌细胞的方法,用原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪和全自动生化检测仪等多种实验手段,检测辐照对细胞膜形态、结构和功能的影响。结果发现HPPM和EMP辐照后,心肌细胞搏动减慢,形态异常,活力下降,凋亡和坏死率明显增加。细胞膜出现数量不等、大小不一的电穿孔,细胞膜通透性丧失,结构破坏,细胞培养液中Na 、K 、Ca2 、Cl-、Mg2 、Ca2 和无机磷离子浓度显著升高(P<0.01),细胞内Ca2 浓度显著降低(P<0.01)。结果提示心肌细胞是电磁辐射损伤的敏感细胞,脉冲电磁场可致心肌细胞膜电穿孔,细胞形态、结构和功能均受到严重损伤。电穿孔效应是解释电磁辐射非热效应的关键机制之一。电穿孔导致的细胞膜通透性和膜结构改变存在一定发展规律。     

转化生长因子β-1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究

目的添加转化生长因子_1β(TGF_β1)以及与内脏内胚层样END_2细胞共培养,定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化,探索联合使用化学诱导法与共培养法对ESCs的心肌细胞定向诱导分化作用。方法将ESCs悬浮培养形成2~3 d类胚体(EBs),再向培养液内添加TGF_β1,或(和)将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养。自然分化为对照组。免疫荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(α_actin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果向培养液添加TGF_β1或将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养,各自有(43±2.08)%(P<0.01),(69±3.61)%(P<0.01),(65±3.06)%(P<0.01)的EBs出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白α_Actin和TnT,观察到心肌样超微结构。自然分化组发生自发节律性收缩的EBs只有(12±1.53)%,尤其是联合使用两种诱导方法,自发性收缩的EBs高达(91±1.52)%(P<0.01),收缩区域较单一诱导组大,且细胞形态较单一。结论联合使用化学诱导和共培养2种诱导法对ESCs的心肌细胞定向分化有协同作用。     

TGF-β1联合内脏内胚层END-2细胞诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞及与凋亡的关系

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化过程中分化与凋亡的关系,为优化组织工程的种子细胞提供依据。方法:先将ESCs悬浮培养形成2-3 d拟胚体(embryoid bodies,EBs),再向培养液中添加转化生长因子-β1(TGF-β1),以及与内脏内胚层样END-2细胞条件培养液共培养联合诱导ESCs向心肌细胞分化。以自然分化为对照组。激光共聚焦显微技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。用AnnexinⅤ/PI双染后,在流式细胞仪上检测ESCs分化过程中的凋亡情况。结果:EBs经TGF-β1诱导后,有(43.00±2.08)%的拟胚体出现自发节律性收缩,表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构,尤其是联合TGF-β1和END-2细胞条件培养液诱导,自发性收缩的拟胚体高达(88.00±1.42)%(P<0.01),收缩区域较大且拥有较成熟的心肌样结构。然而自然分化组发生自发节律性收缩的拟胚体只有(12.00±1.53)%。经2种诱导条件诱导后,检测两者的凋亡率分别为(5.58±0.65)%,(9.60±0.75)%(P<0.05)。结论:联合TGF-β1和内脏内胚层样END-2细胞条件培养液对心肌细胞分化有较高的诱导率,两者发挥协同诱导作用,可能机制是直接诱导ESCs分化或促进不向心肌细胞分化的ESCs凋亡。     

Simultaneous recording of ATP-sensitive K+ current and intracellular Ca2+ in anoxic rat ventricular myocytes. Effects of glibenclamide

We investigated the temporal relationship between the adenosine triphosphate-sensitive K current (K _ATP current), hypoxic shortening and Ca accumulation in cardiomyocytes exposed to anoxia or metabolic inhibition. Whole-cell, patch-clamp experiments were performed with nonstimulated isolated rat heart ventricular muscle cells loaded with the Ca-sensitive fluorescent dye 1-[2-(5-carboxyoxazol-2-yl)-6-aminobenzofuran-5-oxy]-2-(2′-amino-5′-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (fura-2) via the patch pipette. After approximately 8 min anoxia, the K _ATP current started to rise and reached a maximum of 21.3 ± 3.7 nA (n = 5, recorded at 0 mV clamp potential) within 1–3 min. At that time hypoxic contracture also occurred. Resting cytoplasmic free calcium (Ca_i) did not change significantly before hypoxic shortening. After hypoxic contracture, the K _ATP current decreased and Ca_i started to rise, reaching about 1 μmol/l. The presence of glibenclamide (10 μmol/l) in the bath reduced the anoxia-induced K _ATP current by more than 50%, but did not significantly influence the time dependence of current, hypoxic shortening and Ca_i, or the magnitude of Ca_i. Metabolic inhibition with 1.5 mmol/l CN resulted in K _ATP current increase and hypoxic shortening, occurring somewhat earlier than under anoxia, but all other parameters were comparable. In non-patch-clamped cells loaded with fura-2 AM ester and field-stimulated with 1 Hz, 1 μmol/l glibenclamide had no significant effect on the magnitude of the Ca_i increase caused by exposure of the cells to 1.5 mmol/l CN⁻. After CN⁻ wash-out in non-patch-clamped cells, Ca_i declined, oscillated and finally returned to control values. It can be concluded that glibenclamide inhibits anoxia-induced K _ATP currents only partially and has no significant effect on anoxia-induced rise in resting Ca_i. Received: 3 November 1995/Received after revision: 9 January 1996/Accepted: 16 January 1996     

银杏叶提取物对小鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响

目的 探讨银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, EGb)对缺氧/复氧所致心肌细胞氧化应激损伤的保护作用.方法 将原代大鼠心肌细胞分为空白对照组(Con组)、高剂量EGb对照组(C160组)、缺氧/复氧组(H/R组)、低剂量EGb组(EGb40组)、中剂量EGb组(EGb80组)、高剂量EGb组(EGb160组).采用四唑盐(MTT)法检测各组细胞活力,采用酶联免疫吸附法检测各组细胞的MDA含量、SOD活力、GSH与GSSG含量,并计算GSH/GSSG比值以及GSH/GSSG氧化还原电势(Eh(GSH/GSSG)).结果 与Con组相比,H/R组的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)升高(P<0.01),细胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力降低(P<0.01).EGb40、EGb80和EGb160组的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)较H/R组降低(P<0.01),细胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力升高(P<0.01),且呈浓度依赖性(P<0.01).结论 EGb具有明显的抗氧化应激能力,EGb预处理可明显衰减H/R心肌细胞所受的氧化损伤.