骨桥蛋白在免疫相关性疾病中的作用

骨桥蛋白(osteopontin,OPN),又称早期T淋巴细胞激活因子-1,具有经典的分泌型OPN(sOPN)和新近被证实的胞内型骨桥蛋白(iOPN)两种亚型,在免疫反应的不同层面中扮演重要角色.OPN能够促进免疫介导疾病和炎性疾病进展、调节宿主对感染的反应.OPN的作用及机制在部分疾病中已被阐明,但在多种疾病中仍不明确.OPN与一系列免疫相关疾病相关,包括多发性硬化、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮及B细胞相关性疾病等.值得关注的是,OPN与致病性T细胞尤其是Th17细胞关系密切;OPN对B细胞分化的作用也逐渐清晰.OPN一方面在上述疾病中具有致病性,但某些情况下又具有保护作用,因此未来需要更多研究阐明OPN在不同疾病中的作用及机制.     

人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

文题释义： 黄韧带骨化症：是由于脊柱黄韧带发生骨向分化而形成的一种韧带骨化疾病,常导致椎管狭窄,造成脊髓受压,并产生不可逆损害,出现肢体感觉障碍,严重的将导致瘫痪。目前对黄韧带骨化病因学研究取得了一定的进展,但其具体的发病机制仍未完全明确。 自噬：因外界或自身环境的改变,细胞器和胞内蛋白通过溶酶体进行分解消化并重新利用,从而达到适应外界环境、维持细胞内环境稳定的过程,是真核细胞特有一种表现形式。 MAPK信号通路：是生物体内重要的信号转导系统之一,它可以被物理应激、炎性细胞因子、生长因子以及细胞复合物等一系列细胞外信号或刺激激活,从而参与介导细胞生长、发育、分裂以及分化等多种生理及病理过程。在哺乳动物细胞中MAPK信号通路的主要信号分子包括ERK1/2、JNK以及P38等。 背景：黄韧带骨化发生的病理机制尚不清楚,临床上无有效的药物或非手术治疗的方法。目前研究发现,骨桥蛋白与自噬在成骨过程中均发挥重要作用,二者在黄韧带骨化中的作用尚不清楚。 目的：通过对骨桥蛋白和自噬在黄韧带骨化发生机制的研究,尝试找出药物治疗的潜在作用靶点。 方法：①黄韧带骨化病、胸椎骨折或单纯腰椎间盘突出症患者行后路全椎板切除减压获取黄韧带,将标本分为骨化组和非骨化组,每组各取8例标本,通过免疫组化染色观察骨桥蛋白、骨钙素及自噬指标Beclin-1、LC3、P62的表达;②通过组织块贴壁法进行黄韧带细胞的分离培养,并用不同质量浓度的骨桥蛋白干预不同时间来构建体外黄韧带细胞骨化模型;③非骨化组黄韧带细胞用不同浓度的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预后,再用100 μg/L骨桥蛋白诱导,应用Western blot检测骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达变化;④用100 μg/L骨桥蛋白干预非骨化黄韧带细胞,并在0,15,30,60,120 min终止骨化诱导过程,应用Western blot检测MAPK信号通路中重要分子ERK1/2、JNK、P38的磷酸化情况;⑤非骨化组黄韧带细胞用ERK1/2特异的磷酸化阻滞剂U0126阻断ERK1/2通路磷酸化后,再用100 μg/L骨桥蛋白诱导,应用Western blot检测碱性磷酸酶以及骨钙素的表达变化。 结果与结论：①骨化黄韧带和非骨化黄韧带组织骨钙素、骨桥蛋白的免疫组化均呈阳性表达;骨化黄韧带组织中Beclin-1呈阳性表达,而LC3及P62未见明显阳性结果;非黄韧带骨化组织中Beclin-1、LC3、P62均呈阳性表达;②与非骨化组比较,骨化组黄韧带细胞中碱性磷酸酶和骨钙素的表达增加;骨桥蛋白可诱导黄韧带骨化,骨桥蛋白的作用具有浓度相关性和时间相关性;③自噬强弱与骨化程度呈负相关,即自噬越明显,骨化作用越弱;④骨桥蛋白能使MAPK信号通路磷酸化,并具有一定的时间相关性;抑制MAPK磷酸化过程后,骨桥蛋白仍然能够诱导黄韧带细胞的骨化;⑤结果表明,黄韧带骨化发生过程中,信号通路上ERK1/2、骨桥蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶分子的上下游关系为：ERK1/2→骨桥蛋白→骨钙素/碱性磷酸酶。 ORCID: 0000-0003-0008-9802(许国峰) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

miR-449a通过靶向KLF4蛋白导致血管平滑肌细胞表型转化

目的探讨miR-449a对于血管平滑肌细胞表型转化、增殖和迁移的作用。方法首先构建携带miR-449a抑制剂、miR-449a mimic的质粒和携带KLF4 siRNA的病毒,并将其转染到血管平滑肌细胞当中,用即时荧光定量PCR检测miR-449a的量,用Western blot检测KLF4的表达量,并检测表型转化相关代表蛋白SM-MHC、α平滑肌肌动蛋白、骨桥蛋白。同时,用CCK-8和细胞划痕试验来评估细胞的增殖和迁移状况。用免疫荧光检测蛋白表达量及细胞结构变化。用荧光素酶报告基因实验来证实miR-449a与KLF4之间的关系。结果实验发现,miR-449a的下调可以增加KLF4的表达以此达到促进血管平滑肌细胞表型转化的作用,并增加其增殖和迁移能力。结论可以通过上调miR-449a降低KLF4的表达,从而抑制血管平滑肌细胞的表型转化及降低其增殖和迁移能力。     

甲氨喋呤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜骨桥蛋白和整合素αVβ3表达的影响

目的 探讨甲氨喋呤对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠滑膜骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及其受体整合素αvβ3表达的影响及其作用机制.方法 建立CIA大鼠模型,分为模型组和甲氨喋呤(MTX)组,后者用MTX进行干预治疗;采用免疫组织化学染色技术检测滑膜组织OPN和整合素αvβ3的表达,ELISA方法检测血清TNF-α水平.结果 ① CIA模型组和MTX组大鼠的滑膜OPN、整合素αvβ3表达均明显高于正常大鼠对照组(均为P<0.01);与模型组比较,MTX组OPN和整合素αVβ3的表达减少(均为P<0.01). ②正常对照组和MTX组大鼠血清TNF-α水平显著性低于模型组大鼠(均为P<0.01).结论 滑膜OPN和整合素αvβ3异常表达在CIA发病中具有重要意义.MTX通过下调滑膜OPN和整合素αvβ3的表达,降低血清TNF-α水平从而达到治疗CIA的作用.     

胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖的作用

背景:研究表明外泌体具有促进骨再生的能力,但从胎牛血清中提取的外泌体是否可以促进骨形成仍存在争议。目的:观察胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,从而为临床治疗骨破坏提供新思路。方法:通过超速离心法从胎牛血清中提取外泌体,采用透射电子显微镜和Western blot法验证外泌体是否提取成功;然后用10 mg/L胎牛血清外泌体干预成骨前体细胞MC3T3-E1,通过CCK-8实验检测外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,Western blot检测外泌体对成骨细胞骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白表达的影响。以不含外泌体的胎牛血清培养的MC3T3-E1细胞为对照组。结果与结论:①胎牛血清外泌体具有典型的脂质双层膜结构,大小在30-150 nm之间,外泌体表面标记因子CD81表达呈阳性,而微囊表面标记物CD40表达呈阴性;②外泌体组的增殖能力明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);外泌体组成骨标志性因子骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,胎牛血清外泌体对成骨细胞的增殖起促进作用,可为临床治疗骨破坏提供新思路。     

血管成形术后血管外膜α-SMA、PCNA和OPN表达变化及意义

目的探讨大鼠胸主动脉血管成形术后血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)和骨桥蛋白(OPN)表达的变化与血管外膜增殖的关系。方法6周龄健康、清洁纯系雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠32只,体质量为(200±20)g;随机将其分为实验组和对照组,实验组大鼠用6 F人冠状动脉快速交换球囊扩张及剥脱胸腹主动脉内膜,对照组大鼠行胸腹主动脉假手术处理,术后第2周取胸主动脉,进行α-SMA、PCNA及OPN免疫组织化学检查;第6周取胸主动脉做组织形态学检查,并进行对比分析。结果对照组胸主动脉见α-SMA外膜和内膜极少量表达及中膜均匀表达;PCNA外膜和内膜极微量表达及外膜OPN阳性表达。实验组胸主动脉外膜和新生内膜α-SMA、PCNA及OPN阳性表达较对照组明显增强,而中膜α-SMA表达明显减弱。实验组胸主动脉外膜厚度和细胞数量及细胞增殖指数较对照组明显增加(P<0.05)。结论血管成形术后,血管外膜成纤维细胞被激活、增殖,向肌成纤维细胞表型转变,外膜OPN表达增多,外膜增厚,参与血管收缩性重塑。     

透明质酸影响人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44的表达

背景：在骨关节炎病程中,透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表达水平改变,但是滑膜组织中骨桥蛋白、CD44的高表达是否与透明质酸水平改变相关目前尚不清楚。 目的：通过透明质酸干预体外培养的人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞,观察透明质酸对骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44表达的影响。 方法：选取接受膝关节镜手术和膝关节置换的原发性膝关节骨关节炎患者滑膜标本10例,进行体外培养获取纯化的滑膜成纤维细胞,取第4~6代滑膜成纤维细胞,分为3组：空白对照组不进行任何干预;透明质酸组用100 mg/L透明质酸干预24 h;透明质酸酶组用300 mg/L透明质酸酶干预24 h。 结果与结论：与空白对照组相比,透明质酸组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平上升(P < 0.05),透明质酸酶组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平下降(P < 0.05)。透明质酸组和透明质酸酶组之间膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)。空白对照组、透明质酸组和透明质酸酶组滑膜成纤维细胞CD44 mRNA表达水平差异均无显著性意义(P > 0.05)。提示透明质酸可以使骨关节炎滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达增高,对CD44 mRNA表达没有影响。     

骨桥蛋白在大鼠肝缺血/再灌注损伤中的作用

目的 研究大鼠肝缺血/再灌注损伤(HI/RI)过程中骨桥蛋白(OPN)的作用。方法 将大鼠分为假手术组(sham)和缺血/再灌注(I/R) 6、12和24 h组,每组6只。苏木精-伊红染色(HE染色)观察肝组织的形态学变化;比色法检测大鼠血浆中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR测定肝组织OPN mRNA表达;ELISA测定肝组织OPN含量。结果 与sham组相比,HE染色提示I/R后肝细胞有明显的变性和坏死,以I/R 24 h组最为明显;血浆中AST和ALT水平增高,I/R 12 h时最显著(P<0.01);肝组织中MDA含量升高、SOD活力降低,I/R 24 h最显著(P<0.01);肝组织OPN mRNA表达量在I/R各组均有显著升高(P<0.01),OPN含量在I/R 24 h组显著增加(P<0.05)。结论 OPN参与了大鼠HI/RI的发生,它可能是评价肝脏损伤的重要指标。     

炎症分子核因子κB及骨桥蛋白在骨关节炎患者膝关节液中的表达及临床意义

目的 分析炎症分子核因子κB及骨桥蛋白在骨关节炎患者膝关节液中的表达及临床意义.方法 选取46例采取人工全膝关节置换术治疗的骨关节炎患者作为观察组,另选同期的46例外伤截肢、半月板损伤、交叉韧带断裂、盘状软骨损伤等行手术治疗的患者作为对照组,分别采用免疫组化法、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测观察组与对照组患者膝关节液中的炎症分子核因子κB及骨桥蛋白的表达水平,根据骨关节炎诊治指南(2007年版)对骨关节炎患者分为早期、中期、晚期,比较观察组与对照组、不同临床分期骨关节炎患者膝关节液中炎症分子核因子κB及骨桥蛋白的表达水平,采用Spearman相关分析炎症分子核因子κB及骨桥蛋白与骨关节炎临床分期、炎症分子核因子κB与骨桥蛋白的相关性.结果 观察组膝关节液中的炎症分子核因子κB及骨桥蛋白表达水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05);不同临床分期骨关节炎患者膝关节液中炎症分子核因子κB及骨桥蛋白的表达水平差异有统计学意义(P＜0.05),炎症分子核因子κB及骨桥蛋白的表达水平随着临床分期增加而提高;经Spearman相关分析,炎症分子核因子κB及骨桥蛋白与骨关节炎临床分期均呈正相关(r =0.714、0.498,P＜0.05),炎症分子核因子κB与骨桥蛋白呈正相关(r=0.512,P＜0.05).结论 骨关节炎患者膝关节液中的炎症分子核因子κB及骨桥蛋白表达水平显著提高,骨桥蛋白可能通过炎症分子核因子κB信号转导途径参与骨关节炎的发生、发展,根据两者的表达水平来判断病情的严重程度具有积极作用.     

低氧和高二氧化碳作用下肺动脉高压形成过程中骨桥蛋白表达与分布的实验研究

目的： 观察慢性低O2高CO2大鼠肺动脉骨桥蛋白（OPN）及其基因的表达与分布情况，探讨OPN在肺动脉高压发病机制中的作用。方法： 48只雄性SD大鼠随机分为4组：即正常对照组（NC组），低O2高CO2 1周、2周和4周组（1HH、2HH和4HH）。采用RT-PCR法测定不同低O2高CO2 组大鼠离体肺动脉和肺组织骨桥蛋白（OPN）mRNA，免疫组织化学染色法测定肺细小动脉骨桥蛋白分布表达情况，ELISA 法定量测定肺组织匀浆OPN水平，Western blotting 法测定离体肺动脉OPN表达水平。结果： ①低O2高CO2各组大鼠mPAP和RV/LV+S均明显高于NC组（P<0.01），4组大鼠间mCAP比较无显著差异（P>0.05）；②低O2高CO2 各组大鼠肺组织和离体肺主动脉OPN mRNA表达水平显著高于对照组（均P<0.01）；③免疫组化法显示NC组大鼠肺组织OPN表达主要见于支气管、肺泡上皮细胞内，1HH组大鼠肺细小动脉内皮细胞、平滑肌细胞以及周围巨噬细胞均见有OPN的表达，其中以中膜平滑肌细胞最为明显，而2HH和4HH组大鼠OPN表达更加明显, 低O2高CO2 各组肺细小动脉OPN相对含量与对照组比较有显著差异（均P<0.01），且随缺氧时间的延长，骨桥蛋白表达也呈增高趋势；④ 低O2高CO2 各组大鼠肺组织匀浆OPN含量分别为正常对照组的1.69倍、2.28倍和2.87倍（均P<0.01）；⑤ Western blotting 分析1HH、2HH和4HH各组大鼠离体肺动脉OPN表达明显增强，与NC组比较有显著差异（均P<0.01）。结论： 慢性低O2高CO2能够刺激大鼠肺组织和肺动脉OPN及其基因表达增强，OPN可能在慢性低O2高CO2性肺动脉高压发病的病理和病理生理过程中起着重要的作用。