TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化

目的；克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex），构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法：抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞，用RT－PCR、巢式－PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA，并克隆到pGEM-T Easy载体中，DNA测序鉴定，将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T，构建重组表达质粒pGEX/TRAILex，用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段，GST－Agarose 4B层析柱纯化GST－TRAILex融合蛋白，Western-blot鉴定纯化产物。结果：抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达，成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因，构建了重组表达载体pGEX/TRAILex，IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段，经12％SDS－PAGE分析，可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达。Kodak软件分析表达GST－TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％，进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达，用GST－Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清，每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST－Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论：成功地克隆了人TRAIL基因，并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段，为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

肿瘤相关抗原p16的表达和纯化及其在癌症检测中的应用

肿瘤抑制蛋白p16是一个细胞cyclin依赖的细胞激酶抑制因子，具有调节细胞分裂周期的重要功能，p16基因的突变与肿瘤发生密切相关。以往的研究表明与细胞恶性转变有关联的一些蛋白如p53，c—mye，p62和survivin等可以诱发机体产生自身抗体，而这些自身抗体可以作为监测肿瘤发展的标志。是否血清中p16抗体也可作为一个肿瘤诊断的标志仍需要进行评价。本研究用GST融合蛋白纯化系统对体外表达的p16重组蛋白进行纯化，并进一步将其用做肿瘤抗原对癌症病人血清中存在的p16抗体进行检测。初步结果表明在多种肿瘤病人的血清中都可检测到p16抗体。由于本研究使用的样本数有限，是否p16抗体可以作为肿瘤的一个诊断标志仍需要做进一步的研究证实。     

简便快速微量提取鼠疫菌质粒DNA方法的研究

检查鼠疫菌有多种方法,用检查鼠疫菌所含质粒鉴定鼠疫菌也是一种较好的方法,尤其对非典型鼠疫菌最为适用。简单快速微量提取质粒的方法可应用于现场。此外,在遗传工程实验中,常常在配合生物学鉴定时,尚须对大量的转化接合等菌落作质粒抽提鉴定,以及从细菌中快速提取小     

载氧血红蛋白纯化工艺研究

目的改善心脑血管缺氧载氧药物是一种创新药物。由于它半径比红细胞小400~1 000倍,易于通过毛细血管,给缺血组织及时供氧,迅速缓解或纠正缺氧状态,达到治疗抢救目的。血红蛋白的纯化工艺是载氧药物研制的重要工艺步骤。方法本研究建立了一套通过热敏法分离纯化人脐带血血红蛋白的工艺以及较为完善的纯化血红蛋白质量检测指标。结果与现有的纯化方式相比,热敏法操作简便,仪器设备造价低廉,纯化与病毒灭活同时进行,得到的纯化产品损失少,纯度高,各项理化指标达到国际水平。结论本工艺适用于规模制备纯化血红蛋白,为进一步研制治疗心脑血管缺氧载氧药物创造了有利条件。     

猪喉软骨硫酸软骨素的制备和自由基清除活性

直接用木瓜蛋白酶水解软骨,三氯醋酸除蛋白质,乙醇沉淀干燥得硫酸软骨素粗多糖,经DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析分离纯化,高效凝胶渗透色谱和琼脂糖凝胶电泳测定其相对分子质量和纯度,比较硫酸软骨素粗品和纯品的体外自由基清除活性。结果显示硫酸软骨素粗品和纯品提取率分别为31.56±0.46%和19.79±0.78%,后者相对相对分子质量为75 174,粗品的DPPH.和.OH清除活性最强,随着产品纯度的提高,活性降低,而对于O2-.清除活性结果则相反。     

健脑灵口服液提取工艺研究

健脑灵口服液主要由淫羊藿、益智、甘草等中药组成 ,具有补肾扶阳、益精生髓、健脑益智 ,主要用于记忆减退、智力障碍、老年性痴呆。实验发现本方提取工艺对疗效影响显著 ,本处方中大多数有效成分为水溶性成分 ,故工艺上采用水煎煮法 ,采用正交设计试验 ,以淫羊藿中有效成分淫羊藿苷含量为考核指标 ,对水煎煮法提取工艺进行了优选。同时 ,对益智中挥发油的提取及乙醇沉淀的浓度进行了考察。1　仪器、试剂与药品岛津 LC- 1 0 AT高效液相色谱仪 (日本 ) ;CLASS- LC1 0色谱工作站 ,甲醇为色谱纯 ,其他试剂均为分析纯。淫羊藿苷对照品购自…     

产青霉素酶淋病奈瑟球菌耐药质粒的提取与酶切分析

目的 了解产青霉素酶淋病奈瑟球菌(PPNG)在本地区的分布状况及其耐药质粒的限制性核酸内切酶长度多态性分析。方法 用碘量法筛选PPNG株，碱变性法进行质粒抽提，回收7．4kb及5．4kb质粒进行酶切分析。结果 68株临床分离株筛选出PPNG菌3株，经限制性核酸内切酶长度多态性分析，PPNG菌7、4kb及5．4kb质粒含有BamHⅠ的双酶切位点，7.4kb质粒含有PstⅠ及HindⅡ单酶切位点。结论 PPNG菌株的筛选及耐药质粒的酶切分析为追踪耐药菌株的流行趋势提供了流行病学信息。     

重组血红素加氧酶-2在大肠杆菌中表达与纯化方法的研究

目的　确定重组血红素加氧酶 2在大肠杆菌中表达与纯化方法。方法　将已构建的血红素加氧酶 2(HO 2 )的重组质粒pMW1 72a HO 2转入大肠杆菌BL 2 1 ,分析不同温度及摇床转速对HO 2表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超声波、超速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化HO 2。检测酶活性。结果　确定了HO 2可溶性表达最佳条件为 37℃ ,(85± 5 )r min ;确定了HO 2具体纯化路线。得到蛋白纯度为 95 .0 % ,纯化倍数为 2 .9倍 ,收得率为 4 0 .9%的活性HO 2蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的HO 2蛋白 ,为进一步进行HO 2结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

人胚细胞提取物拮抗环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的研究

目前，抗癌、抗突变剂的研究日益增多，其中一些化合物本身具有致突变作用，应用于人体可能有不同程度的副反应．因此．寻找有效而副反应小的抗突变成份．对肿瘤与遗传病的防治有重要意义．     

小檗碱提取新工艺

<正> 小檗碱(berberine)属广谱抗菌药物,是黄连的主要成分。因黄连生长在海拔2000M以上山区,属多年生植物,一般栽种3～5年后才能收获,且产量低(约150kg/亩),故不能满足市场需要。目前多从小檗科植物三颗针、防已科植物古山龙、芸香科植物黄柏等中提取小檗