19例新型冠状病毒Omicron变异株感染儿童的核酸检测结果分析

目的 分析新型冠状病毒(简称新冠病毒)Omicron变异株感染患儿的核酸检测结果,了解该型病毒在儿童中传播的特点。方法 收集2022年1月28日至2022年3月3日杭州市西溪医院隔离病区收治的19例新冠病毒Omicron变异株感染患儿的临床资料。采用实时逆转录PCR技术检测患儿上呼吸道及粪便标本中可读框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因,以循环阈值(Ct)来评估病毒载量。比较不同性别、年龄和临床分型患儿鼻咽拭子、咽拭子、粪便标本ORF1ab基因和N基因Ct值的差异。结果 患儿鼻咽拭子、咽拭子、粪便标本新冠病毒核酸阳性持续时间分别为(16.37±6.42)、(15.37±7.66)和(7.94±4.33)d。≤3岁组患儿鼻咽拭子、咽拭子标本新冠病毒核酸阳性持续时间均长于>3岁组患儿(均P<0.05)。女童鼻咽拭子标本ORF1ab基因Ct值低于男童(P<0.05)。轻型患儿粪便标本ORF1ab基因Ct值低于普通型患儿(P<0.05)。结论新冠病毒在≤3岁儿童呼吸道中的排毒时间较>3岁儿童更长,女童上呼吸道的新冠病毒载量较男童更高,传播病毒的潜力更大...     

实时定量RT-PCR的原理及方法

实时定量RT-PCR广泛应用于定量检测mRAN表达水平,为基础研究、分子药物学和生物技术研究提供了一种有力的方法。该法具有易操作、高通量、敏感性高和特异性强的特点,随着新酶、新探针和新仪器的发展而得到快速的发展。本文将对实时定量RT-PCR的定量原理、仪器应用、探针种类的研究进展以及细胞因子mRNA表达水平检测上的应用作一综述。     

海洛因对小鼠初级精母细胞影响的形态定量分析

将昆明小鼠随机分为低(0.025)、中(0.05)、高(0.1)剂量组及生理盐水对照组,以2号海洛因经腹腔注射染毒,20天后,取睾丸组织制成石蜡切片.HE染色,光镜下观察生精小管上皮细胞的形态变化,并应用图像分析系统对初级精母细胞的形态参数进行了分析;结果表明,(1)光镜观察 对照组及低剂量组小鼠睾丸组织未见明显的变化;中剂量组小鼠睾丸曲细精管上皮有不同程度的组织改变;高剂量组小鼠生精管壁细胞明显地出现上皮层次减少,精子细胞和精子减少,并发现曲细精管内有脱落的生精细胞;(2)形态定量分析显示 低剂量组及中剂量组各形态参数(中剂量组圆形度除外)较对照组无显著差异;高剂量组初级精母细胞核面积、核灰度与对照组相比无显著差异,细胞面积、细胞周长及浆面积较对照组明显增大(P<0.05).而核浆比例、圆形度较对照组有减小(P<0.05).结果提示 海洛因可明显改变小鼠生殖细胞的形态结构.     

荧光定量聚合酶链反应检测人类疱疹病毒7型方法的建立及应用

1990年，首次从健康人外周血单个核细胞中分离到人类疱疹病毒7型(human herpes virus type 7，HHV-7)。HHV-7为双链DNA病毒(145kh)，主要感染CD4^ 淋巴细胞、唾液腺。HHV-7感染可引发婴儿急疹、热性癫痫发作、慢性疲劳性综合征和单核细胞增殖异常等。HHV-7与HHV-6同属人类β-疱疹病毒，两者在细胞病变特点和分离培养条件方面相似，HHV基因诊断是目前较理想的诊断和鉴别诊断方法。传统定性聚合酶链反应(PCR)技术曾被广泛应用于临床诊断，但存在不能定量、特异性不够等缺陷。     

一株铜绿假单胞菌中检出两种新的整合子

目的研究铜绿假单胞菌多重耐药的临床分离株RJ217中发现的两个新整合子的结构，并分析其在多重耐药性中的作用。方法用改良三相试验分析RJ217产β-内酰胺酶的情况，用常规和长片段PCR法扩增耐药基因和整合子，并对PCR产物进行序列分析。结果发现铜绿假单胞菌RJ217携带两个新的整合子，其中一个携带veb-I型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因，这两个整合子的结构分别为IS10-like-veb-I-aadB-oxa10／aadA1和aadB-oxa10／aadA1。结论整合子介导的耐药基因在RJ217的多重耐药性中发挥了重要的作用。     

HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core，C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)表达，探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV-1bc基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒，建立表达c基因插入突变体编码蛋白Huh-7细胞系，按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司H0u133A和Hg-u133b芯片杂交。对基因表达上调或下调≥3倍的基因，用NetAflk作进一步分析。并用半定量RT-PCR对其中3个上调基因进行鉴定。结果Microarray分析显示，HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白比c蛋白引起更多的基因表达改变，主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等，特别是免疫反应基因表达更加显著。C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因／抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调。半定量RT-PCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALSI的鉴定结果表明，FHL2、PRKCZ和LGALSI基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调。结论Hcvc基因插入突变体编码蛋白在Huh-7细胞表达对其基因表达有很大影响，其中对免疫反应基因的影响更明显，这一结果对理解HCV C基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值。     

三利IL-15基因转染NCI-H446细胞模型的建立与鉴定

目的构建并鉴定三种IL-15基因转染的人小细胞肺癌(NCI—H446)细胞模型。方法PCR法扩增得原型IL-15基因片段(FhIL-15)、IL-15成熟肽基因片段(FhIL-15mp)和IL-2信号肽基因片段(FhIL-2sp)；利用重叠延伸基因拼接法将FhIL-15mp和FhIL-2sp拼接成改型IL-15基因片段(FhIL-2sp-hIL-15mp)。将三种IL-15基因片段(FhIL-15、FhIL-15mp和FhIL-2sp-hIL-15mp)分别插入真核表达载体pEGFPN1构建成相应的重组质粒(PhIL-15、PhIL-15mp和PhIL-2sp-hIL-15mp)，用脂质体法分别转染NCI-H446、G418筛选得三种IL-15基因转染的NCI-H446细胞(C-hIL-15、C-hIL-15mp、C-hIL-2sp-hIL-15mp)。对所得的各基因片段和重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定；对所得的各转染细胞，用RT-PCR法检测hIL-15mRNA的表达，ELISA法检测hIL-15蛋白的分泌。结果琼脂糖凝胶电泳和测序证明，FhIL-15、FhIL-15mp、FhIL-2sp-hIL-15mp电泳条带位置和基因序列正确。三种转染细胞均有IL-15mRNA表达，但仅C-hIL-2sp-hIL-15mp可测到22pg/mL的IL-15蛋白分泌。初步应用表明，三种转染细胞确有不同的免疫生物学特性。结论正确构建了三种IL-15基因转染的NCI—H446细胞模型，可在进一步研究IL-15基因与肿瘤细胞免疫生物学特性的关系及至机制中应用。     

用荧光定量-聚合酶链反应比较不同核染色方法对经激光显微切割组织细胞DNA聚合酶链反应的影响

在石蜡切片中，对特定细胞或组织进行显微切割和分离是一项非常重要的技术，特别是对研究异质性肿瘤(如癌前病变、原发肿瘤等)的基因改变和形态学之间联系很有帮助。在进行显微切割时，为了辨别细胞或组织的形态或功能，往往要进行组织化学染色或免疫组织化学。这就有可能对DNA模板的质量和聚合酶链反应(PCR)的反应系统造成影     

不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA

登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒 ,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆 ,复制型 (RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板 ,复制中间体 (RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的。经RT PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增 ,当限制性引物终浓度为 2 5 0nmol L ,两引物比例为 1 0 0∶1时 ,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物。此单链产物用于标记探针进行核酸杂交。结果表明不对称PCR制备单链探针进行核酸杂交可用于检测病毒复制型RNA和复制中间体RNA的合成     

中国汉族雄激素过多症女性21-羟化酶缺陷症携带者基因检测

目的　初步了解中国汉族女性雄激素过多症患者中2 1-羟化酶缺陷症(2 1- hydroxylasedeficiency,2 1- OHD)携带者发生率,探讨促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)兴奋试验结果与基因突变检测结果的相关性。方法　82例汉族女性雄激素过多症患者及14名健康女性进行ACTH兴奋试验,并应用PCR扩增产生限制性酶切位点方法检测已知的9个2 1- OHD常见突变位点。结果　雄激素过多组(n=82 ) F0 显著高于正常对照组(P<0 .0 1) ;17- OHP0 及17- OHP6 0 也显著高于对照组(P<0 .0 1) ,而F6 0 差异没有统计学意义(P>0 .0 5 )。比较17- OHP净增值及17- OHP净增值/ F净增值,雄激素过多组也均显著高于正常对照组(P<0 .0 1)。正常对照组未检测出细胞色素P4 5 0 (cytochrome P4 5 02 1,CYP2 1)基因突变。发现雄激素过多组4例CYP2 1基因突变携带者(4/ 82 ,4 .9% ) ,分别携带V2 81L(2例) ,i2 g及Q318X(各1例) ,携带者的ACTH兴奋试验结果与正常对照及未检出突变的雄激素过多症患者的结果存在一定的交叉。结论　82例汉族雄激素过多症女性中2 1- OHD携带者为4例,占4 .9%。ACTH兴奋试验不能用以发现携带者,应进行基因检测确定。