冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价

冬虫夏草为我国传统名贵中药材。资源短缺、价格昂贵和巨大的市场需求导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重,亟需建立快速有效的鉴别方法。该研究基于实验前期已建立的冬虫夏草快速鉴定SS-PCR方法,按照体外诊断试剂评价标准开发试剂盒,并对试剂盒的特异性、检测限、重复性及保存期4项性能进行了评价。结果显示冬虫夏草质量占混合物质量的1/200(质量分数0.5%以上)以上时可被成功检测。试剂盒对冬虫夏草及其伪品的检测结果显示,仅有冬虫夏草可被成功扩增,并在紫外下显示绿色荧光。该试剂盒37℃温育7 d仍有效,说明4℃保存其在1年内稳定有效。同一批次试剂盒在不同条件下,不同批次试剂盒在相同条件下,其检测结果均一致且准确,表明试剂盒具有良好的批内及批间重复性。将该试剂盒用于市售冬虫夏草及其混伪品的检测,操作简单快速,结果准确可靠,为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了基础。     

人工培育冬虫夏草子实体的鉴别

目的建立人工培育冬虫夏草子实体鉴别方法。方法通过性状及薄层色谱进行鉴别。结果本品性状上和市面上常见几种虫草区别较大,薄层色谱图中证明含虫草素和腺苷两种主成分。结论本试验中所用子实体为一种新型中药,含天然冬虫夏草的特征性成分。     

虫草多糖调节小鼠T淋巴细胞及其亚群数量的机制研究

目的 研究冬虫夏草菌丝体多糖（虫草多糖）对正常小鼠T淋巴细胞及其亚群数量的影响及可能的机制。方法 ICR小鼠,随机分成空白对照组、阳性组（香菇多糖1 mg·kg^-1）和虫草多糖高、中、低剂量（200,100,50 mg·kg^-1）组,连续腹腔注射10 d后,流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞（CD³⁺细胞）及其亚群细胞CD4⁺CD8^-和CD4-CD8+数量、CD³⁺细胞凋亡率;MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化功能;实时荧光定量PCR检测脾脏组织Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的转录水平,并测定胸腺和脾脏指数。结果 与空白对照组比较,虫草多糖能提高小鼠脾脏质量、促进未经ConA诱导的脾淋巴细胞增殖转化能力,并呈现剂量依赖性;虫草多糖高剂量组能明显增加外周血CD³⁺细胞和CD4⁺CD8^-细胞亚群的数量,降低CD4^-CD8⁺细胞亚群数量,显著提高CD4⁺CD8^-/CD4-CD8⁺的比值;高剂量虫草多糖能明显降低小鼠外周血CD³⁺细胞凋亡率,显著升高脾组织Bcl-2 mRNA转录水平和Bcl-2/Bax比值,而对Bax mRNA转录水平没有明显影响。结论 虫草多糖可刺激小鼠主要免疫器官（胸腺和脾脏）增生,提高T淋巴细胞及CD4^-CD8⁺亚群的数量,其作用机制可能与上调抑制凋亡基因Bcl-2 mRNA的转录,提高Bcl-2/Bax比值,从而抑制淋巴细胞凋亡有关。     

冬虫夏草及其混淆品的鉴别

冬虫夏草系麦角菌科真菌冬虫夏草cordyceps sinensis(Berk)Sacc寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫的子座及幼虫尸体的干燥复合体。为常用中药,首载于《本草纲目拾遗》及《本草从新》。近年来,笔者在做冬虫夏草检验中,发现与同属科凉山虫草、亚香捧虫草的混充。现鉴别如下。1 材料来源 样品为我院药检室收藏的检品留样,由安国市中药材公司提供,经我院中药库与药材标本对比鉴定,分虽为凉山虫草corely-ceps Liangsch ancnsis zang Lin et Hu、亚香捧虫草cordyceps hawresii Gray的子座及复合体。     

冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及癌基因c-fos、c-jun表达的影响

目的 探讨冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其可能的作用机制.方法 用MTT法测定不同浓度冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖的影响,用流式细胞仪分析冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs细胞周期的影响,用免疫细胞化学染色法测定冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖细胞核抗原(PCNA)和癌基因c-fos、c-jun表达的影响.结果 低氧对照组大鼠PASMCs吸光度(A)值明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),1、10、100 mg/mL冬虫夏草组A值呈明显下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.05);低氧对照组S+G2M 期细胞比例明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),冬虫夏草组S+G2M期细胞比例明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组PCNA阳性表达率明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组细胞c-fos和c-jun 蛋白阳性染色平均积分光密度值(AIOD)明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 冬虫夏草水提取物呈浓度依赖性抑制慢性低氧导致的大鼠PASMCs增殖,其抑制作用可能是通过减少细胞内c-fos、c-jun基因和PCNA的表达、降低S期和G2/M期细胞比例来实现的.     

丰度加权法分析冬虫夏草RAPD多态性高度差异及动态变化

目的:检测在冬虫夏草僵虫体、子座和子囊果部位多菌共存和差异表达导致的随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分子标记多态性及其在冬虫夏草成熟过程中的动态变化.方法:采用模糊、整体性RAPD分子标记多态性研究法,选用20条随机引物,应用ZUNIX丰度加权相似度公式和丰度加权聚类法,比对冬虫夏草3个成熟期僵虫体、子座和子囊果部位RAPD分子标记多态性,以及与中国被毛孢的差异.结果:丰度非加权算法忽略了RAPD共有扩增子的丰度差异,而丰度加权ZUNIX相似度算法和聚类法,将扩增子的丰度差异及其在冬虫夏草成熟过程中的动态变化所蕴含的全部菌物分子信息汇入分析,准确获取样本间相似度和构建聚类图.冬虫夏草全部样本的总相似度为0.42,小于总相异度0.58.3个成熟期子座样本的相似度为0.57,僵虫体为0.50.同株冬虫夏草的子座和僵虫体样本的相似度随着成熟过程出现低→高→低的变化.子囊果部位与成熟子座的相似度最高(0.87),汇入一个聚类分枝;未成熟子座和僵虫体聚为另一分枝;这两个分枝聚为一群.而成熟中子座和僵虫体聚为一个分枝,与成熟僵虫体聚为另一群.中国被毛孢与冬虫夏草样本的相似度为0.55～0.69,与冬虫夏草聚类群之间被外群对照蛹虫草拟青霉分隔.结论:冬虫夏草各部位的RAPD分子标记多态性丰富,随着冬虫夏草的成熟而变化;冬虫夏草与中国被毛孢的RAPD多态性存在巨大差异,支持冬虫夏草是多菌和多种突变基因型菌共生的统一微生态系统的学说,不支持“冬虫夏草是一种真菌”和“中国被毛孢是冬虫夏草的无性世代”的学说.     

名贵中药当“藏品”过期质量难保证

随着“收藏保值”热的日渐升温,收藏品范围也从金银珠宝、古玩玉器逐渐扩展到人参、鹿茸、冬虫夏草、麝香等名贵中药材以及安宫牛黄丸、片仔癀等高档中成药。然而中草药和西药一样也应有有效期限。中草药在储存管理的过程中会因为外部环境而发生质变。也有影响中草药质变的因素,如日光、空气、湿度、温度、时间及微生物等。日光中有一些紫外线对药品变化起催化作用,能加速中草药中的有效化学成分氧化、分解等。     

冬虫夏草cDNA-AFLP银染法显带研究

目的探讨影响冬虫夏草扩增片断长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP）的主要因素,建立并优化冬虫夏草AFLP反应体系。方法变性裂解液法提取冬虫夏草基因组cDNA,分别用一步法和两步法进行酶切与连接,再进行预扩增、选扩后,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测。结果本研究建立适用于冬虫夏草的AFLP体系：用乙醇沉淀cDNA,建立的模板不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EeoRI完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃3h,连接时间为16℃过夜,缓冲液选用NEB公司buffer2;选择性扩增后的银染显色在10℃以下。结论本研究建立的反应体系适用于冬虫夏草基因组cDNA的AFLP银染法显带研究。     

复方丹参滴丸联用金水宝胶囊治疗2型糖尿病肾病早期的临床观察

[目的]探讨复方丹参滴丸联用金水宝胶囊对2型糖尿病肾病早期微量白蛋白尿的影响。[方法]68例早期2型糖尿病肾病患者随机分为2组,联合用药组35例,开搏通组33例。测定患者治疗前后24h尿微量白蛋白排泄率(UAE)及内生肌酐清除率(C_Cr)。[结果]联合用药组降低UAE,总有效率为94.3%,明显优于开搏通组的60.6%,P<0.05。联合用药组的C_Cr明显低于开搏通组,P<0.01。[结论]复方丹参滴丸与金水宝胶囊联合治疗早期糖尿病肾病,可降低尿微量白蛋白和内生肌酐清除率,延缓糖尿病肾病发展,效果显著。     

冬虫夏草菌丝对乙型慢性病毒性肝炎免疫功能的影响

乙型慢性病毒性肝炎存在着不同程度的免疫功能失调,尤其是细胞免疫功能失调的情况,经临床观察发现具有培本补虚作用的冬虫夏草能升高CD4+、NK细胞,提高CD4+/CD8+比值。同时还能降低IgM水平。说明冬虫夏草不仅具有良好的调整细胞免疫功能的作用,而且对体液免疫功能也有一定的调节作用。