脂质-鱼精蛋白-DNA复合物的构建及其对细胞的体外转染

目的研究新型非病毒载体脂质-聚阳离子-DNA（LPD）复合物的制备方法及其对体外细胞的转染率。方法用薄膜-挤压法制备空白阳离子脂质体，与鱼精蛋白-DNA复合物在室温孵育后，得到LPD；用透射电镜观察其形态，用激光粒度仪测定其粒径和zeta电位；LPD与DNA酶I溶液在37 ℃下孵育不同时间后，用琼脂糖凝胶电泳观察其降解情况；用荧光法测定其包封率；用X-gal染色法考察了LPD对张氏（Chang）肝细胞，HepG2肝癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞的转染率。结果LPD的形态近似于球体，平均粒径为143.5 nm，平均zeta电位为+32.6 mV；37 ℃下核酸酶作用2 h后，LPD中的DNA几乎无降解；平均包封率为93.42%；LPD对张氏（Chang）肝细胞、HepG2肝癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞的转染率分别为(69±6)%，(43±7)%和(96.2±1.8)%。结论LPD是一种制备工艺简单、体外稳定性好、转染率高，具有应用潜力的非病毒载体系统。     

转染癌胚抗原基因的人树突状细胞疫苗表达的研究

目的　探索使用质粒转导制备转基因DCs疫苗的方法。方法　采用细胞因子rhIL 4和rhGM CSF诱导培养法制备人外周血树突状细胞 ,用Lipofectine向人DCs转染含人CEA真核表达质粒。结果　转染组DCs培养上清CEA含量明显高于未转染组培养上清CEA含量。结论　人CEA真核表达质粒转染DCs可内源性表达CEA     

CD与bcl-Xs基因联合转染卵巢癌细胞株对5-氟胞嘧啶作用的影响

目的　了解自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因 (cytosinedeaminase ,CD)及其前药 5 氟胞嘧啶 (5 fluorucytosine,5 FC)和bcl Xs基因转移联合作用对卵巢癌细胞株生长的影响。方法　以复制缺陷型腺病毒为载体将CD基因和bcl Xs基因体外转染大鼠卵巢癌细胞株NUTU 19细胞 ,加入含 5 FC的培养基。MTT法检测培养细胞吸光度值 ,计算细胞存活率。结果　单一bcl Xs基因转移及单一CD /5 FC系统作用对NUTU 19细胞的生长抑制作用均随病毒滴度的增加而增大 ;将两者联合作用于NU TU 19细胞 ,其生长抑制率比两者单独使用时的生长抑制率之和更高 ,表现为协同效应 (P <0 .0 0 0 1)。结论　CD /5 FC系统与bcl Xs基因转移联合使用对NUTU 19细胞的生长抑制具有协同作用。     

抑癌基因PTEN的表达对大肠癌细胞转移侵袭能力的影响

目的探讨抑癌基因PTEN的表达大肠癌细胞转移侵袭能力的影响.方法1.利用western blot法检测不同转移潜能的大肠癌细胞系内PTEN蛋白的表达水平,说明PTEN蛋白的表达对大肠癌细胞转移潜能的影响,2.用脂质体作载体,将PTEN基因转染大肠癌细胞株LOVO后,采用计数细胞悬液加到粘附底物后20 min和120 min的细胞贴壁数用以测定细胞粘附能力,采用Costar的浸润小室检测PTEN基因转染前后细胞的浸润能力.结果1.转移潜能高的LOVO细胞PTEN的表达量显著低于转移潜能较低的HT-29,LS-174T,2.未转染细胞(LOVO)、转染pcDNA3.0-PTEN的细胞(LOVO/pcD-NA3.0-PTEN)在特异性粘附底物(Laminin)上20 min时贴壁率分别为18.6%±1.4%和13.9%±0.48%(P＜0.05),120min时贴壁率分别为71.2%±2.5%和56.0%±1.6%(P＜0.05),3.采用Costar的浸润小室对LOVO、LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞的浸润能力分析结果显示细胞悬液静置培养6 h后,对照细胞LOVO浸润穿透多聚碳膜的细胞数为11.7±1.74个,LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞穿透多聚碳膜的细胞数为7.5±1.58个(P＜0.05).结论在肿瘤细胞内抑癌基因PTEN的表达与大肠癌的转移侵袭行为密切相关.     

嵌合性启动子HRE.CArG的构建及对肝癌细胞乏氧和射线应答的调控

实体瘤中乏氧区的存在是影响放疗效果最主要的因素之一[1].在一个基因启动子内利用乏氧和射线应答元件联合,限制治疗基因仅在乏氧和/或受照组织激活,可提高治疗比率.该文研究目的是构建包含HREs和CArG元件的乏氧-辐射嵌合性基因启动子,并观察乏氧及照射时该启动子诱导增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在BEL7402肝癌细胞中的表达变化.     

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的:构建血管生成抑制因子arresten基 因的真核表达载体,并观察瘤内注射质粒DNA 脂质 体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:利用 PCR方法,由重组质粒pGEM Arr中扩增出基因;将 该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮 下注射HepG 2细胞,成瘤后以成功构建的质粒 DNA 脂质体复合物瘤内注射,治疗后采用免疫组化 方法检测肿瘤血管密度,并利用arresten基因瘤内注 射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果:我们 成功构建arresten基因真核表达载体(pSTbAT)。实 验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15.3个 阳性血管/10个视野,对照组平均112.5个阳性血 管/10个视野)。结论:瘤内注射arresten基因质粒 DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成,并能抑 制移植瘤的生长。     

p27kip1的过表达对肾癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究外源性 p27kip1 基因对肾癌细胞周期、细胞凋亡及增殖的影响。方法:将含p27cDNA的质粒在脂质体介导下在体外转染肾癌GRC 1细胞,Western Blot、FCM及MTT检测分析外源性 p27kip1 蛋白在细胞内的表达,观察其对细胞周期、凋亡及细胞增殖的影响。结果:体外转染 GRC 1 细胞 48 h 后, p27 蛋白在p27kip1转染后的 GRC 1 细胞中高表达。FCM检测表明,细胞停滞于 G1 期,实验组 G1 期细胞占66 9%,并出现亚G1 凋亡峰;而空白对照组和转染空载体组 G1 期细胞分别为 32 2% 和33 8%。MTT 法检测表明,转染 p27cDNA 后,实验组细胞增殖明显受抑。结论: p27kip1 基因在体外转染GRC 1细胞并过表达p27kip1蛋白,抑制细胞由G1 期向 S期过渡,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究

目的 构建含TK自杀基因的质粒表达载体并进行转染研究。方法 根据已发表的Hsv-TK基因的核苷酸序列，设计并合成一对引物，以含TK基因的PGEM/TK质粒为模板扩增出TK基因全长CDS序列，将其克隆到质粒表达载体pcDNA3．1(-)CMV中，进行序列分析和酶切鉴定后，运用电穿孔法将重组体pCDNA3．1(-)CMV-CD车专人鼻咽癌CNE-2细胞中，观察其表达情况以及无毒前体药物GCV干预下对CNE-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和序列分析证明pcDNA3．1(-)(2MV．TK含完整的TK基因序列，RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出预期片段；鼻咽癌CNE-2细胞在无毒前体药物GCV干预下，其生长受到抑制。结论 成功构建了质粒载体pcDNA3．1(-)CMVTK，可以将其作为鼻咽癌自杀基因治疗的一种载体。     

Vascular Endothelial Growth Factor165-regulated Nasopharyngeal Carcinoma Cell Lines Invasion and Migration Involve Expression and Activation of Matrix Metalloproteinase-2

The effect of vascular endothelial growth factor （VEGF） overexpression on matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in nasopharyngeal carcinoma （NPC） cells in vitro and the possible mechanism involved were investigated, and the correlation between the expression of VEGF and MMP-2 in NPC evaluated. The NPC cells were transfected with PAd-trackVEGF165 plasmid. The expression levels of VEGF and MMP-2 mRNA and protein in NPC cells were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blot respectively. It was found that the expression of VEGF and MMP-2 mRNA and protein was significantly increased in NPC cells after transfection of VEGF 165. It was concluded that the expression of VEGF was correlated to the in vitro invasion of NPC cells, and the induction of MMP-2 by VEGF was a key process of NPC cell invasion.