转化生长因子β1诱导肾小管上皮细胞转分化的蛋白质组学研究

目的 研究转化生长因子（TGF）β1诱导肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中相关靶蛋白的表达变化。 方法 应用比较蛋白质组学方法。用双向凝胶电泳（2-DE）对TGF-β1刺激组和对照组 NRK52E细胞总蛋白进行分离。两组间差异蛋白点用质谱和数据库搜索鉴定，并用RT-PCR和Western 印迹在蛋白质和mRNA水平上进一步检测验证。 结果 鉴定出22个差异蛋白，包括与细胞骨架相关蛋白、参与物质转化和能量代谢的酶类、与蛋白翻译后修饰相关蛋白、细胞因子及其他蛋白等。应用RT-PCR验证了转胶蛋白（transgelin）、ATP合成酶α亚型、苹果酸脱氢酶、丝氨酸（半胱氨酸）蛋白酶抑制因子、泛素结合酶9（Ubc9）和表皮生长因子8在mRNA水平的表达差异，与2-DE结果一致。用Western 印迹验证了transgelin、ATP 合成酶α亚型两种蛋白的表达差异，亦与2-DE结果一致。 结论 TGF-β1刺激NRK52E细胞EMT发生过程中可诱导包括与细胞骨架相关蛋白、与翻译后修饰相关蛋白、代谢酶类及细胞因子等多种蛋白表达变化。本研究结果有助于深入理解EMT的具体分子机制及阐明肾脏疾病慢性进展的机制。     

股骨头缺血性坏死组织差异表达蛋白质的鉴定和功能蛋白质组学初步研究

目的应用组织蛋白质组学方法寻找与成人股骨头缺血性坏死（ONFH）相关的蛋白质。方法于非创伤性ONFH患者股骨头中分别采集坏死骨组织样品与正常骨组织样品各12份,采用四步溶剂法提取骨组织中的总蛋白,应用多维液相色谱与串联质谱联用技术和生物信息学方法对组织蛋白进行分离鉴定和功能蛋白质组学分析。结果坏死组织样本和正常组织样本中鉴定二肽段以上的高可信度蛋白质数量分别为1302个和999个,假阳性率为0．9％。通过与对照组的质谱计数,在坏死骨组织中鉴定了141个高表达蛋白和56个低表达蛋白。基因本体论蛋白功能分析发现34种蛋白质与ONFH密切相关。本实验在股骨头坏死组织中证实ChST2基因（硫酸软骨素蛋白聚糖合成过程中的关键蛋白）和GPCR26基因（介导细胞内钙离子动员的蛋白质）的低表达。结论非创伤性ONFH存在复杂的信号传导通路。硫酸软骨素蛋白聚糖的生物合成和多种离子的转运、动员可能参与ONFH发病机制中的关键过程。研究发现的差异表达蛋白可能成为ONFH早期临床诊断的候选生物学标志物。     

大鼠精索静脉曲张睾丸组织的蛋白质组学研究

目的精索静脉曲张是男性不育的首要病因,本课题利用蛋白组学技术筛选精索静脉曲张大鼠睾丸中表达变化显著蛋白,探索精索静脉曲张引起不育的可能分子机制。方法雄性Wistar大鼠16只,随机分为对照组和精索静脉曲张实验组。实验组大鼠施行左肾静脉部分结扎术来诱导产生精索静脉曲张,对照组行假手术作为阴性对照。30d后,收集全部大鼠的左侧睾丸。采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（Tunel）法检测两组大鼠生精细胞凋亡情况,进而比较两组生精细胞的凋亡指数。利用双向凝胶电泳技术（2-DE）寻找两组大鼠睾丸中表达有显著性差异的蛋白质点,然后进行基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱鉴定（MALDI-TOFMS）。结果双向凝胶电泳结果显示21个蛋白质点在两组间存在显著性差异。在精索静脉曲张大鼠睾丸中有8个蛋白质点表达上升、13个下降,这些蛋白功能涉及蛋白质合成、加工、降解,基因表达调控,信号转导,能量代谢,凋亡,自由基代谢等。Tunel证实实验组大鼠睾丸中生精细胞凋亡指数显著高于对照组,且本实验筛选出14—3—3e、hnRNPF以及LZTFL1三种蛋白与凋亡相关。结论蛋白组学筛选出精索静脉曲张大鼠睾丸差异表达蛋白,并进一步证实精索静脉曲张促进睾丸生精细胞凋亡,其中相关凋亡蛋白对揭示精索静脉曲张引起男性不育的分子机制提供了可能。     

炎症性肠病患者混合样本策略的蛋白质组学研究

目的 应用混合样本策略的蛋白质组学方法在炎症性肠病患者血清中寻找与疾病相关的蛋白质.方法 选取2007年3月至2008年6月中山大学附属第六医院收治的炎症性肠病患者以及健康受试者血清蛋白样本各8例,混合样本后用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内双向差异凝胶电泳,并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和生物学信息分析.应用DeCyder V6.0软件中的胶内差异分析及生物学差异分析软件进行统计分析.组间比较采用t检验.结果 成功建立炎症性肠病和健康受试者的胶内荧光差异染色双向凝胶图谱,发现了炎症性肠病患者中存在56个表达异常蛋白质点,质谱分析和数据库检索筛选后共鉴定出30个点有意义,包括结合珠蛋白、补体B因子、载脂蛋白A-Ⅱ、K-ras基因等.结论 采取混合样本策略、双向差异凝胶电泳、MALDI-TOF-MS技术路线的蛋白质组学方法能很好显示炎症性肠病患者与健康受试者血清蛋白质表达差异,所鉴定的蛋白质可为研究炎症性肠病的生物学行为提供新的分子标志物.     

MALDI-TOF-MS分析新疆食管鳞状细胞癌的蛋白组学

目的:分析新疆食管鳞状细胞癌和食管正常上皮细胞的差异表达蛋白.方法:运用激光捕获显微切割技术(LCM)分别获取食管鳞状癌细胞和食管正常上皮细胞,应用二维凝胶电泳技术(2-DE)分离纯化细胞,Imagemaster 2D软件比较分析两者电泳图谱的差异,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定分析两者表达的差异蛋白.结果:建立了食管鳞状癌细胞和食管正常上皮细胞的2-DE图谱,获得43个差异蛋白点,通过质谱鉴定出17种蛋白,其中15种蛋白如Trangelin2、HSP27、S100A11、GSTP等在食管鳞状癌细胞中表达明显增高,2种蛋白如SCCA1,在食管鳞状癌细胞中表达明显降低.结论:提示17种差异蛋白可能与食管鳞状细胞癌的发生和发展有关,为筛选食管鳞状细胞癌的特异性分子标志物奠定基础.     

胃癌和慢性胃炎患者幽门螺杆菌蛋白质组学分析

背景：胃癌的发生是一个多因素多步骤的过程,幽门螺杆菌（H．pylori）感染在此过程中发挥重要作用。目的：建立胃癌和慢性胃炎H．pylori的双向凝胶电泳（2-DE）图谱,识别鉴定差异表达的蛋白质．探讨细菌本身因素在胃癌发病过程中的作用。方法：取H.pylori而阳性的胃癌和慢性胃炎患者胃黏膜组织后分离培养H.pylori,收集菌体并采用BCA法行蛋白定量,以2-DE分离Hpylori蛋白．采用PDQuest软件分析差异表达的蛋白质点．应用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（Q—TOF）进行鉴定,并在Mascot数据库中进行检索。结果：胃癌和慢性胃炎H．pylori总蛋白均获得分辨率高、重复性好的2-DE图谱。共6个蛋白质点在胃癌和慢性胃炎中存在表达差异．其中超氧化物歧化酶、尿素酶仪亚单位、分子伴侣60kDa在胃癌Hpylori菌株中高表达,而巯基过氧化物酶、二磷酸核苷激酶、S．核糖基同型半胱氨酸裂解酶在慢性胃炎H．pylori菌株中高表达。结论：成功建立了分辨率高且重复性好的胃癌和慢性胃炎H．pylori蛋白的2-DE图谱,并鉴定出两种疾病相关菌株中差异表达的蛋白质点．这些蛋白质点可能在胃癌的发生中起重要作用。     

利用蛋白质组学技术筛选辐射致癌相关蛋白质

背景与目的:辐射致癌的机制目前尚不明确.本研究通过建立辐射致癌的细胞模型,应用蛋白质组学技术观察辐射癌变细胞和正常细胞间的差异蛋白表达谱,以期获得辐射致癌相关蛋白.方法:选取永生化的人支气管上皮细胞株(BEAS-2B),利用γ射线照射诱导癌变,建立辐射致癌的细胞模型.利用二维凝胶电泳技术,筛选癌变细胞和正常细胞间的差异表达蛋白点并进行质谱鉴定分析.通过Western blot技术对其中4个蛋白:ENO1、Prx I、Dyrk2和GPX1在辐射致癌不同阶段的表达情况进行分析.结果:在辐射癌变细胞和正常细胞间共得到可信差异表达蛋白点59个.其中14个仅在癌变细胞中表达,15个仅在正常细胞中表达,23个在癌变细胞中表达降低,7个在癌变细胞中表达升高.通过质谱分析,共有26个蛋白点得到鉴定,主要包括一些参与细胞代谢、增殖、分化的酶类、信号调控蛋白、DNA结合蛋白以及一些细胞结构蛋白和少数功能不明的蛋白及肽段.其中ENO1和Prx I随辐射癌变的进展而升高,Dyrk2和GPX1随辐射癌变的进展而降低.结论:应用二维电泳技术可获得辐射致癌差异表达蛋白谱,筛选和鉴定出与辐射致癌相关的差异表达蛋白,并可检测部分差异蛋白在辐射致癌不同阶段的表达情况.     

SELDI-TOF-MS技术在乳腺癌临床蛋白质组学研究中的应用

临床蛋白质组学将蛋白质技术应用于临床医学研究，尤其是恶性肿瘤的临床研究。表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术是目前临床蛋白质组学研究最为有效的技术之一，被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床研究。在针对乳腺癌早期诊断、个体化治疗、治疗药物监测等方面都有许多积极的探索。虽然这一技术应用于临床尚不成熟，但它对乳腺癌的诊断、治疗具有广阔的应用前景。