神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制

目的 观察大鼠脑缺血再灌注损伤基质金属蛋白酶-9(matrix metallopmteinases,MMP-9)表达及神经调节素-1β(neuregulin-1β,NRG-1β)的干预作用.方法 成年健康雄性Wistar大鼠200只,应用线栓法经颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注(models of middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)动物模型,治疗组经颈内动脉单剂量注射1.5%NRG-1β 5μl干预.氯化三苯基四氮唑(TFC)染色测定脑梗死体积,原位脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)方法检测细胞凋亡,免疫组织化学、免疫荧光双标记法和免疫印迹法观察脑组织MMP-9表达.结果 脑缺血再灌注损伤可诱导大脑皮质和纹状体区脑组织细胞凋亡和MMP-9表达.随着缺血缺氧时间的延长,对照组皮质区细胞凋亡数量自缺血0、0.5、1.0、1.5和2.0 h逐渐增加,分别为1.78±0.15、5.78±0.51、10.35±0.77、21.50±1.19和32.00±1.78;而纹状体区细胞凋亡数量自缺血0、0.5、1.0、1.5和2.0 h也逐渐增加,分别为1.46±0.21、4.12±0.54、7.33±0.71、16.54±1.63和19.03±1.44(t=9.31～37.78,P<0.01);对照组MMP-9蛋白表达逐渐增加(t=7.73～27.75,P<0.01).应用NRG-1β后,皮质区细胞凋亡数量自缺血0、0.5、1.0、1.5和2.0 h明显减少,分别为1.66±0.11、4.80±0.61、5.63±0.56、9.75±1.22和13.54±1.26;而纹状体区细胞凋亡数量自缺血0、0.5、1.0、1.5和2.0 h也明显减少,分别为1.34±0.14、3.35±0.32、4.55±0.50、7.63±1.41和10.46±0.98(t=2.74～18.93,P<0.05);MMP-9表达水平较对照组同一时间点相应脑区显著降低(t=3.85-12.09,P<0.01);脑梗死体积明显缩小(t=4.645～13.043,P<0.01).结论 脑缺血后MMP-9表达增强,参与了脑缺血再灌注损伤后的炎症反应过程.NRG-1β可能通过下调MMP-9的表达而抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应诱发的细胞凋亡.     

环氧合酶-2和基质金属蛋白酶-2在膀胱移行细胞癌中的表达及其相关性

 目的　探讨膀胱移行细胞癌组织环氧合酶-2（COX-2）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达及其相关性。方法　应用Western blot方法检测42例膀胱移行细胞癌组织（其中Ta～T1期 18例,T2～T4期24例;G1级12例,G2级19例,G3级11例;有转移26例,无转移16例）和8例正常对照膀胱组织COX-2及MMP-2 蛋白的表达,并分析其与肿瘤分级、分期和转移的关系以及两者的相关性。结果　COX-2在Ta～T1期相对表达量为0.729±0.458,T2～T4期为1.248±0.425,均显著高于正常对照膀胱组织（0.310±0.149）（t值分别为3.56、4.13,均P＜0.05）;COX-2在G1、G2、G3级相对表达量分别为0.616±0.486、1.055±0.406、1.422±0.341,均显著高于正常对照膀胱组织（0.310±0.149）（F＝5.98,均P＜0.05）。MMP-2在Ta～T1期相对表达量为0.844±0.345,T2～T4期为1.458±0.463,均显著高于正常对照膀胱组织（0.460±0.213）（t值分别为3.91、4.83,均P＜0.05）;MMP-2在G1、G2、G3级相对表达量分别为0.736±0.355、1.197±0.394、1.692±0.373,均显著高于正常对照膀胱组织（0.460±0.213）（F＝6.35,均P＜0.05）。在有转移及无转移肿瘤组织中COX-2表达分别为1.246±0.426和0.668±0.421,MMP-2为1.430±0.461和0.814±0.341（t值分别为5.89、6.27,均P＜0.01）。COX-2 与MMP-2的表达呈显著正相关（r＝0.648,P＜0.01）。结论　COX-2 与MMP-2在膀胱移行细胞癌组织高表达,且随肿瘤恶性程度增高而表达增加,二者与膀胱移行细胞癌的发生、发展具有相关性。     

A族链球菌表面蛋白Fba保护性区段的鉴定

目的 将A族链球菌表面蛋白Fba分段克隆、表达,免疫动物并攻毒,以鉴定各区段诱导的保护性免疫并确定保护性最强的区段.方法 根据Fba蛋白的结构特点将其划分为4个重叠区域,以A族链球菌(GAS)的SSI-9为模板,PCR扩增4段蛋白的基因,克隆、表达后,Western印迹鉴定蛋白表达.4段蛋白纯化后分别免疫小鼠,同时设PBS对照组.ELISA检测各免疫组血清IgG水平,并用致死量的GAS(M+Fba+)攻击免疫3次后的小鼠,计算各组保护率.数据行方差检验和Fisher精确概率法.结果 成功构建原核表达质粒pGEX-2T/FbaAl、pGEX-2T/FbaA2、pGEX-2T/FbaA3和pGEX-2T/FbaA4,成功表达了4段蛋白.Fba蛋白免疫小鼠后,实验组血清IgG随免疫次数的增加呈逐渐增高趋势.第3次免疫后,与PBS对照组比较,FbaA2蛋白组效价升高最为明显,达1∶102 400(F=1290.2,P<0.01).攻毒后,FbaA2蛋白组8只小鼠中有4只得到保护,FbaAl、FbaA3及FbaA4蛋白组各8只小鼠中,仅2只得到保护(P<0.05).结论 成功构建、表达了Fba分段蛋白;初步确定FbaA2段可诱导较强的保护性免疫应答.     

Nachweis der Osteokalzinexpression osteoblast?rer Zellen mandibul?ren Ursprungs, wachsend auf Biomaterialien, mittels RT-PCR und SDS-PAGE/Western Blotting

ZusammenfassungFragestellung Die Fragestellung der vorliegenden Untersuchung war, ob in vitro die Isolierung von auf unterschiedlichen Biomaterialien adhärenten osteoblastären Zellen mandibulären Ursprungs und eine Darstellung der Osteokalzin-Gen- und -Proteinexpression aus diesen isolierten adhärenten Zellen während der gesamten Kultivierungsdauer von 14 Tagen möglich ist.Material und Methoden Die osteoblastären Zellen mandibulären Ursprungs wurden aus Knochenbiopsien von einem Patienten isoliert, vermehrt und auf drei unterschiedlichen Biomaterialien (Frios® Algipore®, PepGen P-15, OsteoGraf®/LD-700) ohne Zusatz osteogener Faktoren kultiviert. Am 7. und 14. Tag wurden eine automatische Zellzahlmessung, eine Färbung der alkalischen Phosphatase und eine Bestimmung der Osteokalzin-Gen- und -Proteinexpression mittels RT-PCR und SDS-PAGE/Western Blotting durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine rasterelektronenmikroskopische Darstellung vor und nach der Isolierung der auf Biomaterialien adhärenten Zellen.Ergebnisse Die Isolierung von auf Biomaterialien adhärenten osteoblastären Zellen mandibulären Ursprungs ist mittels der von uns angewandten Methode möglich. Auch die Bestimmung der Expression von Osteokalzin auf Gen- bzw. Proteinebene von auf Biomaterialien adhärenten osteoblastären Zellen war an beiden Untersuchungstagen erfolgreich. In der anfänglichen Inkubationsphase (7 Tage) zeigte die Expression von Osteokalzin keine stärkere Abweichung zwischen den Biomaterialien. Danach (7. bis 14. Tag) kam es zu einer Veränderung des Expressionsmusters, wobei klare Unterschiede zwischen den einzelnen Biomaterialien erkennbar waren.Schlussfolgerung Es konnte gezeigt werden, dass nach Isolierung von auf Biomaterialien adhärenten Zellen mandibulären Ursprungs eine ausreichende Menge an Untersuchungsmaterial zur Darstellung der Osteokalzin-Gen- bzw. -Proteinexpression vorhanden ist. Die Isolierung von ausschließlich auf Biomaterialien adhärenten Zellen dient als Grundlage für weitere Untersuchungen des Wachstumsverhaltens osteoblastärer Zellen in vitro. Informationen über das Gen- und Proteinexpressionsmuster dienen zur besseren Beurteilung der Eigenschaften der verschiedenen Biomaterialien.Diese Untersuchung wurde mit freundlicher Unterstützung der Bank Austria Creditanstalt ermöglicht. Die Autoren widmen diese Arbeit Herrn Professor Rolf Ewers zu seinem 60. Geburtstag.     

喉鳞癌中Ezrin和CD44-v6的表达及临床研究

目的探讨Ezrin、CD44-v6在人喉鳞癌中的表达及临床意义。方法应用Western-blot法检测Ezrin和CD44-v6在36例喉鳞癌组织的癌中心区、过渡区(距肿瘤边缘≤1cm)及无癌区(距肿瘤边缘>1cm)中的表达。结果Ezrin和CD44-v6在喉鳞癌组织的无癌区、过渡区及癌中心区中的表达水平递增;二者的表达与喉鳞癌的T、N分期和病理分级有关;Ezrin和CD44-v6二者之间密切相关。结论过度表达的Ezrin和CD44-v6在喉鳞癌的生长及转移中起重要作用;Ezrin可作为判断喉鳞癌预后的标志物。     

KDR蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及临床意义

目的：探讨卵巢浆液性肿瘤（OSC）与正常卵巢组织中血管内皮生长因子受体（KDR、蛋白）的表达情况及临床意义。方法：利用Western Blotting方法对38例OSC、14例卵巢交界性浆液性瘤、11例卵巢良性浆液性瘤以及10例正常卵巢组织中KDR蛋白进行检测。结果：OSC组织中KDR蛋白表达的阳性率（89．5％）高于卵巢交界性浆液性瘤组织（64．3％）（P〈0．05）。OSC组织中KDR蛋白表达的相对含量（141．10&#177;87．31）明显高于卵巢交界性浆液性瘤（65．60&#177;11．61）组织（P〈0．005）。KDR蛋白在OSC和卵巢交界性浆液性瘤组织中表达的阳性率和相对含量均高于卵巢良性浆液性瘤（18．2％，42．62&#177;12．66）及正常卵巢（10．0％，37．72&#177;12．96）组织（P〈0．05）。手术病理分期Ⅲ期＋Ⅳ期OSC组织KDR蛋白表达的阳性率（96．2％）和相对含量（181．96&#177;96．37）高于Ⅰ期＋Ⅱ期（75．0％，112．37&#177;59．28）OSC组织（P〈0．05）。组织学Ⅲ级OSC组织KDR蛋白表达的阳性率（95．5％）和相对含量（171．76&#177;91．66）高于Ⅰ级（4／6，87．96&#177;35．59），有统计学意义（P〈0．05）。有淋巴结转移的OSC组织中KDR蛋白表达的阳性率（96．2％）和相对含量（219．25&#177;92．4）与无淋巴结转移的OSC组织（75．0％，108．43&#177;30．45）相比较，有统计学意义（P〈0．05）。有腹水的OSC组织中KDR蛋白表达的阳性率（83．3％）及相对含量（139．94&#177;83．94）与无腹水的OSC组织（85．7％，167．07&#177;93．66）相比较，无统计学意义（P〉0．05）。结论：卵巢浆液性肿瘤的发生、发展与KDR蛋白的过高表达密切相关。KDR蛋白表达与卵巢浆液性癌生物学行为相关。     

蛋白免疫印迹法分析纤维连接蛋白分子降解状态

为了解蛋白免疫印迹法在纤维连接蛋白（Ｆｎ）分子降解状态分析中应用效果，观察了８６例慢性阻塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）患者血浆Ｆｎ和５３例急性白血病、１２例淋巴瘤患者脑脊髓液（ＣＳＦ）－Ｆｎ分子状态。发现ＣＯＰＤ患者血浆Ｆｎ降解程度增加，并与ＣＯＰＤ病程和病情相关；急性白血病和淋巴瘤浸润中枢神经系统者，ＣＳＦ－Ｆｎ增高系Ｆｎ片段产生所致。表明蛋白免疫印迹法是一项适合研究体液中Ｆｎ降解片段特性和发现新片段的方法。     

佛山市无偿献血者人类T淋巴细胞白血病病毒感染情况调查

目的 探讨广东省佛山市无偿献血人群中,人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)感染状况,评估经血液传播HTLV的风险,保障临床输血安全.方法 选择2016年2月至12月,于佛山市参加无偿献血的69 275例献血者作为研究对象.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对献血者血浆中HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体进行初步筛查.对初检结果呈反应性的标本再进行双孔复检.对复检结果呈反应性的标本,则判定为HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛结果呈阳性.对初筛结果呈阳性的标本采用Western印迹法进行确证.统计不同性别、年龄、学历、户籍及献血次数献血人群的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体的初筛阳性率,并且采用统计学方法,分别对不同献血人群的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率进行比较.结果 ①本研究69 275例无偿献血者中,HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体呈阳性者为17例,HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率为0.025％.其中,仅2例献血者的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体的Western印迹法确证试验结果呈阳性,确证阳性率为0.003％.②本研究69 275例无偿献血者中,女性献血者的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率为0.042％(11/26 291),高于男性的0.014％(6/42 984),并且差异有统计学意义(x2=5.17,P=0.023).不同年龄段献血者中,46～55岁年龄段献血者的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率最高(0.084％,4/4 768);并且不同年龄段献血者HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率总体比较,差异有统计学意义(x2=8.09,P=0.044).不同学历献血者中,初中及以下学历献血者HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛初筛阳性率最高(0.063％,7/11 113);并且不同学历献血人群HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率总体比较,差异有统计学意义(x2 =7.97,P=0.047).外地户籍献血者HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率(0.033％,15/45 274)高于本地户籍献血者(0.008％,2/24 001),并且差异有统计学意义(x2=3.93,P=0.047).2次及以上献血者HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体初筛阳性率(0.034％,16/46 414)高于首次献血者(0.004％,1/22 861),并且差异有统计学意义(x2=5.65,P=0.017).结论 佛山市属于无偿献血人群感染HTLV的低发生率区或者非流行区.女性、老年、学历低、外地户籍及多次献血的无偿献血人群感染HTLV的风险较大.鉴于输血安全,建议献血前常规检测所有无偿献血者的HTLV-Ⅰ/-Ⅱ抗体,同时对血液进行去除白细胞过滤处理.     

严重急性呼吸道综合征冠状病毒Spike蛋白抗原特异性的临床应用研究

目的 探讨严重急性呼吸道综合征（SARS）患者的SARS冠状病毒（SARS—CoV）抗体产生情况以及SARS-CoVSpike蛋白抗原的特异性。方法 运用酶联免疫法（ELISA）和蛋白质印迹法（WesternBlotting）检测95例SARS患者体内抗体的产生情况和验证病毒Spike蛋白抗原的特异性。结果 95例SARS患者血清抗体结果中，大部分患者出现抗体阳性，抗SARS-CoVIgM总阳性率为91．6％（87／95），抗SARS-CoVIgG总阳性率为97．9％（93／95）；高暴露人群组和正常对照组的抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG阳性率为0％。经过携带Spike-protein基因的重组病毒Ad-sn感染COS-1细胞后表达的s蛋白抗原，使用SARS患者抗血清能够检测出特异性蛋白条带；重组病毒感染CNE-2细胞后，表达的S蛋白抗原，能够通过不同患者抗血清同时检测到相应的特异性抗原蛋白。结论 SARS患者感染SARS-CoV后，体内可产生相应抗体；利用SARS患者所产生特异性抗血清，可以检测出克隆SARS-CoV的Spike基因所表达的Spike蛋白。     

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

为研究氧化型低密度脂蛋白引起血管平滑肌细胞凋亡及其凋亡的机制,采用细胞形态学ＤＮＡ末标记法,流式细胞仪,Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｔｔｉｎｇ观察氧化型低密度脂蛋白诱导培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。结果发现,在氧化型低密度脂蛋白作用下,血管平滑肌细胞阻滞在分裂期的中期,并发生凋亡,ＤＮＡ末端标记法和流式细胞仪检测发现氧化型低密度脂蛋白引起细胞凋亡明显高于天然低密度脂蛋白（前者是后者的１０倍）。电镜下凋亡细胞