伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白特异性区段的基因克隆和表达

目的表达伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白特异性区段，探讨其作为诊断抗原的可行性。方法用ＰＣＲ方法获取与其它种属螺旋体编码鞭毛蛋白的基因序列同源性较低的第４０９－７８６ｂｐ区段，经ＤＮＡ序列测定证实后，经克隆、转化，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达，并做Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｏｌｔ分析。结果重组蛋白在宿主菌内表达高效、稳定，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ示与抗鞭毛蛋白的单克隆抗体有较好的免疫反应性。结论以重组鞭毛蛋白的特异性区段作为诊断抗原具有可行性。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白的分离、纯化和鉴定

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸负染扫描电子显微镜(scanningelectronmicrocopy,SEM)观察并摄片鉴定。考马斯亮蓝法测定所获得鞭毛蛋白的产量。结果SDS-PAGE提示纯化的鞭毛蛋白为一条相对分子质量(Mr)为52×103蛋白带;免疫印迹试验亦提示条带在Mr52×103处;SEM观察发现该鞭毛蛋白呈丝状;三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。蛋白定量测得每克湿重的细菌可提取(4.8±0.5)mg鞭毛蛋白。结论经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,且易于纯化和鉴定。     

莱姆病螺旋体鞭毛平截性蛋白的表达及其诊断潜力研究

目的原核表达伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白Flagellin A基因特异性区段,获得重组鞭毛蛋白平截性蛋白作为诊断抗原,建立间接ELISA方法用于动物莱姆病的诊断。方法 PCR扩增获取伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因的同源性较低的第394-798bp区段,构建重组质粒pGEX-4T-1/tFlaA,构建好的表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,并纯化重组蛋白,用纯化的表达蛋白作为莱姆病诊断的抗原,用于ELISA检测实验感染小鼠莱姆病。结果成功构建莱姆病螺旋体鞭毛平截性蛋白的表达载体,重组蛋白在宿主菌内高效、稳定表达,重组平截性蛋白显示了可作为ELISA诊断的抗原用于莱姆病的诊断价值。结论纯化的伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白可作为莱姆病ELISA诊断抗原用于莱姆病的诊断,为莱姆病快速诊断试剂盒的开发打下基础。     

鞭毛蛋白融合蛋白作为佐剂或疫苗诱导的特异性免疫应答

研究表明鞭毛蛋白能够激发宿主免疫应答。据报道鞭毛蛋白是有效的佐剂，在体内能增强T细胞应答，推测可将鞭毛蛋白作为疫苗佐剂来诱导和加强免疫应答。为了评价鞭毛蛋白能否作为一种载体用于佐剂或疫苗的研制，美国Sidney Kimmel癌症中心Cuadros制备了鞭毛蛋白一增强性绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白，并报告了其诱导特异性免疫应答的结果。     

中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体PD91鞭毛蛋白的基因克隆和表达

目的 对中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因种参照菌株PD91的鞭毛蛋白编码基因进行克隆表达与基因序列分析。方法 设计引物,用聚合酶链反应(PCR)技术获得PD91的鞭毛蛋白编码基因片段,经酶切、连接,插入质粒pET-11d中,构成重组质粒pET11d-fla,转化致大肠埃希菌BL21,提取质粒进行酶切、DNA测序和氨基酸序列分析鉴定,诱导表达,筛选高效表达株,应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)方法,鉴定重组蛋白及其抗原性。结果成功地获得了鞭毛蛋白的编码基因片段和基因重组,重组蛋白在宿主菌BL21中高效表达。WB结果显示重组鞭毛蛋白与PD91的鞭毛蛋白具有相同的抗原性。经测序显示该鞭毛蛋白的基因片段长度为1011bp,与北美莱姆病螺旋体标准株B31的DNA碱基序列及氨基酸序列比较分析,同源性分别为94.70％、95.85％。结论 在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因种的鞭毛蛋白基因进行了克隆表达,并证实具有良好的抗原性,为莱姆病血清学诊断研究提供了较好的基础。     

鞭毛蛋白属共同抗原表位在沙门氏菌分类中的作用探讨

应用４株鞭毛蛋白共同抗原单抗ＣＢ８、ｄｅ７、ｃｃ６和ＤＤ４，在直接ＥＬＩＳＡ试验中测定了鞭毛蛋白属共同抗原表位在沙门氏菌７个ＤＮＡ同源群２１９株菌株中的分布情况。结果表明，它们广泛存在于各个ＤＮＡ同源群内，在沙门氏菌属内的检出率分别高达９５．４％，９３．６％，９５．４％和９２．２％，其中ＣＢ８＋ｄｅ７可达９９．１％。经与脂多糖Ｏ－Ｉ噬菌体识别的共同表位比较研究表明，鞭毛蛋白共同抗原表位更加特异和准确，前者在ＤＮＡ同源群Ⅲａ、Ⅳ中的分布很低或检测不出。这些结果为沙门氏菌属新分类概念提供了新的科学依据，同时预示着鞭毛蛋白属共同抗原表位在沙门氏菌分类中具有重要作用。     

钩端螺旋体鞭毛蛋白B(FlaB)基因flaB在大肠杆菌内的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达钩端螺旋体内鞭毛蛋白 (FlaB)用于钩体病的诊断和预防。方法　将目的基因flaB定向克隆至原核表达载体 pGEX - 5T ,构建重组融合表达质粒 pGF ;Western -blot鉴定其特异性 ,ELISA法判定其用于钩体病诊断的可行性。结果　GST -FlaB主要以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 4 0 % ;Western -blot结果显示该蛋白与FlaB抗血清能呈现明显的单一条带 ;包涵体经TritonX - 10 0及尿素纯化后 ,纯度可达 90 % ,并且能溶于包被缓冲液中 ;ELISA检测显示纯化后的GST -FlaB具有较好的特异性。结论　钩端螺旋体FlaB可以高效表达并可能用于ELISA检测及钩体病的预防。     

125I-rFlic及125I-rFlicΔ180-400的制备及其在同种移植排斥监测中的作用

目的 探讨放射性碘125标记基因重组鞭毛蛋白(¹²⁵I-rFlic)及其片段(¹²⁵I-rFlicΔ180-400)在同种移植模型中的生物学分布及靶向性。 方法 用1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(Iodogen)碘化标记rFlic及rFlicΔ180-400,分析标记率及稳定性,进行放射性配基结合分析;构建小鼠同种/同系皮肤移植模型,于术后第8天尾静脉注射标记物,分析生物学分布和药代动力学特征,进行全身磷屏自显影显像。 结果 成功制备¹²⁵I-rFlic及rFlicΔ180-400,且具有较好的体外稳定性;¹²⁵I-rFlicΔ180-400对移植受体脾细胞亲和力更高。生物学分布结果显示,与¹²⁵I-rFlic组相比,¹²⁵I-rFlicΔ180-400注射组24 h的 移植皮片/对侧正常皮片(T/NT)明显升高,P=0.014 8。药代动力学结果表明,与¹²⁵I-rFlic相比,¹²⁵I-rFlicΔ180-400代谢更快。全身磷屏自显影显像显示,注射后6 h的同种移植皮片放射性浓聚较1 h更明显;与¹²⁵I-rFlic组相比,¹²⁵I-rFlicΔ180-400组移植皮片显像更加清晰。注射后24 h两组均可得到清晰移植皮片显像。 结论 ¹²⁵I-rFlic与¹²⁵I-rFlicΔ180-400在移植皮片处高度特异性浓聚,可成功显示同种移植急性排斥,而后者比前者拥有更快的代谢率和更快的特异性浓聚。     

Toll样受体5激动剂CBLB502对7.0Gy60Coγ射线照射恒河猴的辐射防护作用观察

目的 观察Toll样受体5激动剂CBLB502对7.0Gy 60Coγ射线全身照射恒河猴的辐射防护作用.方法 30只健康成年恒河猴分为对症治疗组、WR-2721(辐射防护剂氨磷汀)组和CBLB502 2.5、10、40μg/kg组,每组6只.所有动物均用60C0 γ射线放射源一次全身双侧照射7.0Gy(剂量率13.00～13.52cGy/min).CBLB502给药剂量为2.5、10和40μg/kg,阳性对照药WR-2721剂量为30mg/kg,对症治疗组注射生理盐水0.3ml/kg,均为照射前0.5h一次肌肉注射.所有动物照射后在同一原则下给予对症治疗.观察各组动物一般体征、外周血象、造血祖细胞集落培养情况及组织病理学检查结果.结果 照射后40d时CBLB502 10、40μg/kg组动物存活率均为100％,而对症治疗组存活率仅为33％(2/6);WR-2721组各系造血恢复稍快于对症治疗组,但差异无统计学意义;与对症治疗组比较,CBLB502 40μg/kg组外周血白细胞和血小板最低值显著增高,血小板低值持续时间缩短,开始恢复时间提前,输血量明显减少(P＜0.05),骨髓、肠道等组织损伤明显减轻.结论 7.0Gy 60Coγ射线全身照射猴均发生了重度骨髓型急性放射病.照前30min一次性给予40μg/kg CBLB502对7.0Gy 60Coγ射线照射猴有明显的辐射防护作用,其效果优于目前常用的辐射防护剂WR-2721.     

131 I-rFliC的制备及乳腺癌荷瘤鼠体内生物学分布特征

目的 探讨放射性碘131(131I)标记基因重组鞭毛蛋白(rFliC)在乳腺癌荷瘤小鼠体内的生物分布特征及意义.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)及免疫荧光检测人乳腺腺癌细胞系(MCF-7)中rFliC的受体TLR5的表达;四氯二苯基苷脲(Iodogen)法131I标记rFliC,检测其放射化学纯度、稳定性、细胞摄取状况;制备MCF-7荷瘤鼠,注射131I-rFliC后,观察其生物学分布及肿瘤靶向性.结果 ①MCF-7表达TLR5的mRNA及蛋白;随着rFliC浓度的增加,TLR5 mRNA及蛋白表达逐渐减弱;②131I-rFliC标记率达95.19％;放射化学纯度为96.46％;在血清中稳定性高,可被MCF-7稳定摄取;③131I-iFliC主要经肝肾代谢,肿瘤靶向性明显,24 h靶/肌肉(T/M)放射性比值为7.09,可获得清晰放射自显影像.结论 131I-rFliC肿瘤靶向明显,有望作为一种新型分子探针监测乳腺癌的发生发展.