沙门氏菌分子生物学研究进展

自1885年Sal mon等分离得到猪霍乱沙门氏菌以来,目前已检出沙门氏菌血清型2500余种,我国已有292个血清型报道[1]。沙门氏菌是重要的人兽共患病病原菌之一,本文就沙门氏菌基因组学、鞭毛蛋白、外膜蛋白以及毒力岛等方面研究进展进行     

MUC2在结肠炎小鼠中的保护作用和血清抗CBir1抗体的表达

目的:探究黏蛋白2(MUC2)对结肠炎模型小鼠肠黏膜的保护作用,并探究抗CBir1鞭毛蛋白抗体与MUC2表达的相关性。方法:将小鼠随机分为正常对照组、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)组、脂多糖(LPS)+卵清蛋白(OVA)+TNBS组和酮替芬+TNBS组,采用PAS染色法和免疫组织化学法测定各组小鼠结肠组织MUC2的表达情况,ELISA法对各组小鼠血清抗CBir1抗体的水平进行测定。结果:各模型组小鼠的疾病活动度指数评分和组织学指数评分中,TNBS组小鼠的分值较正常对照组增高(P0.05),LPS+OVA+TNBS组小鼠的分值较TNBS组更加增高(P0.05),而酮替芬+TNBS组小鼠的分值与TNBS组相比有所降低(P0.05)。PAS染色结果显示,与正常对照组比较,TNBS组杯状细胞减少,LPS+OVA+TNBS组与TNBS组相比结肠黏膜完整性出现破坏,而酮替芬+TNBS组与TNBS组相比杯状细胞数量明显增多。免疫组化染色结果表明,各模型组小鼠肠道内MUC2的表达量与PAS染色结果基本保持一致。TNBS组小鼠血清抗CBir1抗体的含量较正常对照组有所增高(P0.05),LPS+OVA+TNBS组小鼠与TNBS组相比明显增高(P0.05),而酮替芬+TNBS组小鼠与TNBS组相比有所降低(P0.05)。结论:MUC2在结肠炎小鼠的发病过程中具有肠黏膜保护作用。结肠炎小鼠MUC2的表达量与肠道内细菌鞭毛蛋白存在一定的负相关。     

鞭毛蛋白诱导急性肺损伤的研究进展

急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)是急性肺损伤 (ALI)的最严重阶段 ,脓毒血症 (sepsis)是其最多见的原因[1] 。虽然近年提出其发病的全身炎症失控学说 ,认为内毒素脂多糖 (LPS)是脓毒症诱导ALI致病的始动因素 ,而针对内毒素及其诱导产生的一些炎症介质或细胞因子等采取的对抗性措施 ,如应用特异的抗类脂A抗体、抗细胞因子单抗及可溶性受体等 ,虽有某些方面的作用 ,却不能有效防止ALI的发生 ,也不能降低ARDS的病死率。说明脓毒血症时可能存在有别于LPS的其他致伤因素。1　鞭毛蛋白 (flagellin)的结构特征鞭毛蛋白是沙门氏菌鞭毛 (包括基…     

空肠弯曲菌鞭毛蛋白的提取与鉴定

用制备ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分离空肠弯曲菌Ｓ１３１株的菌体蛋白。在ＫＣｌ“染色”背景下，切下６５．４７Ｋｕ蛋白带，经电泳洗脱和浓缩获得的蛋白液，免疫印迹证实为均一鞭毛蛋白。另用亚硝基胍诱导使空肠弯曲菌Ｓ１３１有动力株突变为无动力株，电镜下突变株鞭毛消失，但ＳＤＳ－ＰＡＧＥ谱上仍有６５．４７Ｋｕ鞭毛蛋白区带。提示，这种鞭毛突变可能发生在蛋白质装配阶段。     

单克隆抗体测定沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的分布特性

本研究应用抗沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原的４株羊克隆抗体所建立的直接ＥＬＩＳＡ法，测定了该类抗原表位在沙门氏菌属内外的分布特征。对１８４株覆盖Ａ至Ｏ６７血清群沙门氏菌、９６株其他肠道杆菌和８株革兰氏阳性菌的测定结果显示，该共同抗原表位广泛分布于沙门氏菌全属内，而在属外出现的频率很低。这类表位既存在于Ⅰ相较毛，也存在于Ⅱ相鞭毛。它们的上述分布特性不同于分型抗原Ｏ、Ｈ的分布特征。由此可见，沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原表位具有高度的属特异性，可作为该菌属识别标志，在沙门氏菌快速检验和抗原结构研究方面具有重要应用价值。     

4株沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原组分免疫原性及免疫保护性的研究

采用酸解法、单抗亲和层析提纯了鼠伤寒沙门氏菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）鞭毛蛋白Ｈｉ。经电镜和ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定，发现４２ｋＤ的蛋白带，即鞭毛蛋白（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）。它能够刺激小鼠产生特异性抗体，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、凝集试验（ＤＡ）测定其Ｈｉ抗体效价分别为１：１０４、１：１０３。用其他非Ｈｉ抗原的沙门氏菌包板，ＥＬＩＳＡ效价可达１：１００～１：１０００，ＤＡ阴性。这表明沙门氏菌鞭毛蛋白上存在着属特异共同抗原表位，且免疫原性较好，该类表位免疫性比分型Ｈ抗原弱，提示沙门氏菌分型Ｈ抗原表位是鞭毛蛋白分子上的优势表位。用沙门氏菌鞭毛蛋白属特异共同抗原表位单抗ｄｅ７研究被动保护作用，结果显示该表位被动保护作用很小。本研究为沙门氏菌鞭毛蛋白抗原多样性及特性研究提供了新的认识，并为临床上诊断沙门氏菌感染提供了新的检测对象。     

基于流感病毒M2蛋白胞外区的双层蛋白质纳米颗粒的制备及免疫学效果评价

目的通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒, 探究其在小鼠体内的免疫效果。方法采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定, ELISPOT检测细胞免疫水平, CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果本研究成功制备了粒径为(130.03±2.96) nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600, 抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800, 高于对照组小鼠, 差异均具有统计学意义(t=3.051和3.780, P=0.038和0.019)。与对照组相比, 多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率:(154.18±2.34)%, HAα刺激增殖率:(151.51±1.56)%](t=12.942和24...     

副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析

目的 制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体(mAb)并建立双抗夹心ELISA.方法 采用差速离心法提取副溶血性弧菌ATCC 17802菌株的鞭毛蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,抗血清效价达到1∶32 000时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合.多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水,纯化后得到抗体.结果 获得6株持续、稳定分泌抗副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为VpNo.1～VpNo.6,抗体效价高达1∶2×106.对抗体进行了Ig类和亚类检测以及Western blot法鉴定,其Ig亚类依次为IgGl、IgG1、IgM、IgG1、IgG2a和IgM.SDS-PAGE结果显示,提取出的鞭毛蛋白相对分子质量(Mr)为42 000并且纯度较高.采用VpNo.6抗体建立了副溶血性弧菌双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到103 CFU/mL菌液,通过采用134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌进行特异性实验,结果表明134株副溶血性弧菌呈阳性反应,74株非副溶血性弧菌呈阴性反应,VpNo.6抗体具有非常好的特异性.在基质添加试验中,最低检出限为21CFU/g样品.结论 成功制备了副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb,并将其应用于双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到1×103 CFU/mL菌液,与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应.     

福建省食品中分离的空肠弯曲菌株鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型

目的:采用PCR-RFIP基因分型方法对分离自福建省不同地区不同种类食品中的空肠弯曲菌株的鞭毛蛋白基因flaA进行分型,掌握福建省食品中空肠弯曲菌的基因型别,为流行病学追踪调查提供科学依据.方法:采用欧洲弯曲菌实验室网络Campynet推荐的空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法(http://Campynet.vetinst.dk/Fla.htm).即用PCR技术对弯曲菌的鞭毛蛋白基因/flaA上的一个1700 bp片段进行扩增,再用限制性内切酶Ddel对PCR产物进行酶切,通过凝胶电泳并分析酶切图谱.结果:目前福建省食品中分离的空肠弯曲菌基因型别较多样,34株空肠弯曲菌可分为18个型别.不同地区分离的菌株其基因型多不相同,只有4个型别在不同地区的菌株间有重复.结论:空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法分辨率高,可重复性好,不需要特殊设备,且操作简单、快速,适合于实验室开展,且方法标准化后,能将世界各地获得的数据进行比较,从而能更好的了解各个基因型的区域分布和流行趋势.     

Toll样受体5在鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤中的表达研究

目的检测鞭毛蛋白诱导急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织中Toll样受体5（TLR5）mRNA的表达变化,初步探讨TLR5在鞭毛蛋白致大鼠Au中的作用。方法从大肠杆菌ATCC25922中分离纯化鞭毛蛋白并鉴定。108只SD大鼠随机分为正常对照组（n=36）、致伤1组（n=36）和致伤2组（n=36）。经尾静脉注射鞭毛蛋白以建立大鼠ALI模型。每组分别在6个时相点用原位杂交法检测大鼠肺组织中TLR5 mRNA的表达,并观察动脉血气分析和肺病理改变。结果从大肠杆菌ATCC25922中成功分离纯化出鞭毛蛋白,其分子量约65kD。静脉注射鞭毛蛋白成功建立了大鼠急性肺损伤模型。从致伤后1h开始,鞭毛蛋白致肺损伤大鼠肺组织中TLR5 mRNA表达增加,并随时间推移和鞭毛蛋白剂量增加而表达增多。各致伤组大鼠动脉血氧分压降低,肺组织出现肺间质、肺泡水肿和炎性细胞浸润等病理改变。结论静脉注射鞭毛蛋白可导致大鼠ALI;TLR5作为细胞膜上鞭毛蛋白的受体参与了鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤的作用过程。