反义核酸技术及应用

反义核酸技术是用人工合成的或生物合成的特定互补的DNA或RNA片段阻断从基因到蛋白的信息流 ,以达到抑制或阻断基因表达的生物新技术。利用核酸分子杂交原理将反义寡核苷酸 (antisenseoligonucleotide,ASON)作为外源性基因表达抑制物结合到靶mRNA序列上阻止其翻译成蛋白[1 ] 。具有杂交特异性和选择性调节基因的表达的特点[2 ] ,这一技术不仅已成为常用的实验室研究方法 ,还广泛的应用于研究病毒、肿瘤、寄生虫和遗传性疾病的预防和治疗 ,具有重要的应用前景。对于人类基因的研究 ,人们采用分子克隆、分子杂交、PCR技术等一系列研究…     

反义骨调素寡核苷酸对肾小管上皮细胞骨调素mRNA表达及其胶原凝胶黏附能力的影响

【目的】观察反义骨调素(OPN)寡核苷酸(AS-ODN)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)骨调素mRNA表达及黏附能力的影响;比较AS-ODN的游离形式和经阳离子脂质体(DOTAP)包裹形式的反义抑制效果。【方法】用荧光显微镜观察荧光素标记的AS-ODN在细胞中的分布;将寡核苷酸处理NRK52E细胞48h,用TRIzol试剂提取细胞总RNA;用RNA斑点杂交和RT-PCR检测OPNmRNA的表达;将ODN/DOTAP复合物处理的细胞置于胶原凝胶表面,计算细胞的黏附率。【结果】AS-ODN能转移进入胞核中;AS-ODN处理的细胞OPNmRNA表达水平均较低(P<0.05),而顺义或错义寡核苷酸处理的细胞OPNmRNA水平较高,即使30μmol/L浓度也无抑制作用;游离AS-ODN最低抑制浓度为3.75μmol/L,而AS-ODN浓度为0.5μmol/L的AS-ODN/DOTAP复合物具有良好抑制作用;AS-ODN处理的细胞黏附率降低,而顺义或错义寡核苷酸处理的细胞黏附能力较强。【结论】反义骨调素寡核苷酸能特异地抑制大鼠肾小管上皮细胞OPNmRNA表达和黏附胶原凝胶能力;阳离子脂质体能促进AS-ODN的反义抑制作用。     

核酸杂交反应中影响因素分析

以光敏生物素标记的R3 cDNA克隆为模型,采用正交设计的方法,对影响核酸杂交反应的主要因素:杂交反应温度,反应时间,探针浓度及甲酰胺浓度作了综合性分析。当探针浓度为800μg/L,甲酰胺浓度为10mol/L,50℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度(10pg)。     

DNA探针的高效标记和哺乳动物细胞转化子的检测

本实验采用随机引物法标记探针DNA.探针DNA加热变性成单链,以单链DNA为模板,六聚脱氧核苷酸为引物,在DNA多聚酶I大片段的作用下进行放射性标记.标记探针的比放射性达10~8cpm/μg DNA以上.放射性底物的掺入率为60%.用该方法标记的人高度重复顺序探针,可以检出微微克水平的阳性分子.与人HeLa S_3细胞DNA转化的小鼠LTK~+细胞DNA打点杂交呈阳性,与未经转化的小鼠LTK~-细胞DNA杂交为阴性,证明小鼠转化细胞中存在HeLa细胞DNA,DNA转化是成功的.     

基因芯片技术在头颈部肿瘤研究中的应用

基因芯片近年来发展迅速,凭借其并行性、多样性、微化性和自动化等优点对肿瘤研究带来了巨大冲击,通过对生物遗传信息进行定性、定量分析,在基因诊断和基因治疗方面具有广阔的应用前景.     

Caspase-3反义寡核苷酸抗凋亡作用的研究

目的 研究caspase-3反义寡核苷酸对6-OHDA诱导大鼠中脑多巴胺神经元凋亡的保护作用.方法 向四组SD大鼠的中脑黑质部位注入反义、错义、正义寡核苷酸及NS,然后再注入6-OHDA,取中脑做连续切片,原位杂交及免疫组化检测黑质caspase-3的表达及TH的表达,原位末端标记法(Tunel)检测黑质细胞的凋亡.结果 反义组Tunel阳性细胞数为82±8.6,方差分析显示反义组阳性细胞数显著性低于其他各组(P＜0.05);反义组手术侧TH阳性细胞数为168.6±11.4,与对侧阳性细胞比值为63%±11.3%,显著性高于其余各组(P＜0.05).结论 有效阻断caspase-3的表达可减轻6-OHDA诱导的多巴胺神经元凋亡,caspase-3可作为保护性治疗帕金森病的靶点.     

PAI－1糖基化位点突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）是一种Ｍｒ为５０×１０３的单链糖蛋白，有３７９个氨基酸残基，３个Ｎ型糖基化位点。构建ＰＡＩ－１糖基化突变体，以便研究糖链的功能。用寡核苷酸定位突变技术将３个糖基化位点２０９，２６５，３２９位进行突变，把３个糖基化位点都发生了突变的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ组装到真核表达载体ｐＳＶ２中，得到真核表达质粒ｐＺＨ－ｐ１－Ｍ３Ｅ；在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯｄｈｆｒ－）中进行短暂表达，用发色底物法和夹心ＥＬＩＳＡ方法检测培养液中ＰＡＩ－１的活性和含量。结果：糖基化位点突变的ＰＡＩ－１能在ＣＨＯ细胞中表达，但表达水平及活性较低。非糖基化ＰＡＩ－１的活性和抗原分别为４．３４ＩＵ／ｍｌ和３．１５μｇ／Ｌ结论：用寡核苷酸定位突变方法获得了ＰＡＩ－１糖基化突变体，并且在ＣＨＯ细胞中得到表达。     

32例金属节育环异位的诊断及处理

用本院研制的Ⅲ型刻度软探针放置宫内自行到X线科照像作环定位,21/32例与其他检查法比较,获得准确诊断,环嵌顿子宫肌层占25%,异位盆腔占75%,全部病例经开腹取环证实。说明本软探针对环(或luD)异位诊断是一种安全、简便、可靠的方法。     

支原体全DNA光敏生物素探针杂交方法的建立

支原体基因组全ＤＮＡ分子量较小，本研究直接制备肺炎支原体（ＭＦ），人型支原体（ＭＨ）和解脲脲原体（ＵＵ）中３个型ＳＵ１，ＳＵ４，ＳＵ８全ＤＮＡ光敏生物素探针，用斑点杂交鉴定表明探针可用于检测同种支原体，但３个型ＵＵ探针不能用于型别鉴定。探针检测灵敏度较一般片段ＤＮＡ探针灵敏度低，可能是由于前者分子量放大，降低了杂交速率和效率。直接提取全ＤＮＡ作光敏生物素标记，简化了探针制备过程，且无放射性损害及衰减，探针易于保存，可供一般实验室及化验室使用