Excitotoxic and metabolic damage to the rodent striatum: role of the P75 neurotrophin receptor and glial progenitors

After injury, the striatum displays several morphologic responses that may play a role in both regenerative and degenerative events. One such response is the de novo expression of the low-affinity p75 neurotrophin receptor (p75(NTR)), a gene that plays critical roles in central nervous system (CNS) cell death pathways. The present series of experiments sought to elucidate the cellular origins of this p75(NTR) response, to define the conditions under which p75(NTR) is expressed after striatal injury, and how this receptor expression is associated with neuronal plasticity. After chemical lesions, by using either the excitotoxin quinolinic acid (QA) or the complex II mitochondria inhibitor 3-nitropropionic acid (3-NP), we compared the expression of the p75(NTR) receptor within the rat striatum at different survival times. Intrastriatal administration of QA between 7 days and 21 days postlesion induced p75(NTR) expression in astrocytes that was preferentially distributed throughout the lesion core. P75(NTR) immunoreactivity within astrocytes was seen at high (100-220 nmol) but not low (50 nmol) QA doses. Seven and 21 days after 3-NP lesions, p75(NTR) expression was present in astrocytes at all doses tested (100-1,000 nmol). However, in contrast to QA, these cells were located primarily around the periphery of the lesion and not within the lesion core. At the light microscopic level p75(NTR) immunoreactive elements resembled vasculature: but did not colocalize with the pan endothelium cell marker RecA-1. In contrast, p75(NTR)-containing astrocytes colocalized with nestin, vimentin, and 5-bromo-2-deoxyuridine, indicating that these cells are newly born astrocytes. Additionally, striatal cholinergic neurons were distributed around the lesion core expressed p75(NTR) 3-5 days after lesion in both QA and 3-NP lesions. These cells did not coexpress the pro-apoptotic degradation enzyme caspase-3. Taken together, these data indicate that striatal lesions created by means of excitotoxic or metabolic mechanisms trigger the expression of p75(NTR) in structures related to progenitor cells. The expression of the p75(NTR) receptor after these chemical lesions support the concept that this receptor plays a role in the initiation of endogenous cellular events associated with CNS injury.     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

永久性脑缺血神经干细胞迁移和细胞分裂、增殖的研究

目的　探讨永久性脑缺血神经干细胞 (NSC)迁移是否伴随自身的分裂与增殖。方法　以永久性脑缺血大鼠为模型 ,采用免疫组化染色方法 ,观察脑缺血 1,3,7,14和 2 8dNSC迁移及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果　室管膜下区 (SEZ)NSC和PCNA+ 细胞在缺血后沿胼胝体腹侧向缺血区方向发生了时空一致性的迁移模式 ;缺血梗死灶周围均有较多巢蛋白和PCNA阳性细胞的表达。结论　永久性脑缺血后NSC可能通过自身分裂和增殖向外迁移 ,巢蛋白和PCNA在缺血区周围表达可作为NSC迁移和增殖的标志物。     

巢蛋白在胚胎及新生大鼠脊髓的表达

目的　检测不同发育时期巢蛋白 (nestin)在脊髓神经干细胞的表达水平 ,探讨脊髓神经干细胞的发育规律 ,为分离、富集和增殖均质的神经干细胞以及后期的研究工作如神经干细胞定向分化及移植治疗等研究提供实验依据。方法　将Wistar大鼠按胎龄及日龄分组 ,剥离脊髓 ,制成单细胞悬液 ,经间接荧光法标记nestin抗原 ,用流式细胞仪检测和分析。结果　从E13到P7整个发育过程中都有nestin抗原的表达 ,呈升高趋势 ,其中P1期表达水平最高。出生后表达下降 ,趋近于 90d(同型对照 )表达水平。结论　巢蛋白在脊髓的表达出现于胚胎早期 ,表达水平随胎龄轻微波动 ,呈升高趋势 ,P1达到高峰 ,出生后表达下降 ,趋于成鼠的微量表达     

人胎脑海马部位神经干细胞形态学观察

目的 探讨人胎脑海马部位神经干细胞的形态学发育特点。方法 收集胎龄20～36周的自愿水囊引产胎儿75例，采用免疫组织化学和光镜观察技术对胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式进行检测。结果 神经干细胞主要分布于海马多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层，分子层也可见，细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形，以圆形细胞多见，0～2个突起不等，以1个突起多见。细胞胞浆丰富；核呈圆形及椭圆形，染色质疏松，2～5个核仁不等。多数单个散在分布，可见对称分裂现象，有的干细胞呈簇状分布，有的干细胞突起与别的细胞保持联系。结论 人胎脑海马部位各层均存在神经干细胞，海马可能存在齿状回之外的神经干细胞生发中心。     

激活素A对新生大鼠缺血缺氧后脑组织巢蛋白表达的影响

目的探讨激活素A对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）脑组织巢蛋白的表达变化。方法将7日龄Wistar大鼠120只随机分为3组,假手术组、缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型组和激活素A治疗组,每组各40只。每组根据处死的时间不同又分为5个亚组：6h组、24h组、3d组、7d组、14d组,每亚组各8只。HE染色观察神经细胞形态变化,采用免疫组化的方法测定巢蛋白的表达。结果HIBD组缺氧缺血侧大脑组织巢蛋白活性逐渐增高,3d显著增高,7d达高蜂,然后逐渐下降,14d仍有少量表达;与HIBD模型组各时间点相比,激活素A治疗组各时间点脑组织巢蛋白表达明显增高（P〈0.01）。结论激活素A治疗增高缺氧缺血后巢蛋白的表达,对缺氧缺血性脑损伤有保护作用。     

巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析

目的 在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白（nestin）．制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性．探索神经发育及再生规律。方法 采用RT—PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后．将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Westem blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。Westemblotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果 成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。胛G诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25000的His融合蛋白并被Ni．NTA成功纯化．Westem blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后．经Westem blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestin蛋白。结论 获得了重组人nestin蛋白．制备的抗血清不仅可识别重组nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。     

巢蛋白在人牙齿发育过程中表达的免疫组化研究

目的:探讨巢蛋白(Nestin)在人牙齿发育过程中的表达模式和作用.方法:制备人牙齿发育各阶段以及人成牙本质细胞标本,采用SP法进行巢蛋白的免疫组织化学染色.结果:巢蛋白主要表达于功能性成牙本质细胞和成釉器.结论:巢蛋白参与人牙齿发育过程,特别是成牙本质细胞分化和基质分泌,可以作为功能性成牙本质细胞的标志物.     

戊四氮点燃大鼠海马星形胶质细胞巢蛋白的表达

目的：观察戊四氮点燃大鼠海马各区巢蛋白(nestin)的表达,以探讨其与癫痫发病机制的关系。方法：将20只成年雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组采用戊四氮点燃大鼠模型,观察大鼠痫性发作行为和脑电图表现,用免疫组织化学方法观察海马各区星形细胞活化标志巢蛋白表达的变化。结果：实验组大鼠于4周后均达到点燃状态,而对照组行为正常。2组脑电图背境电活动以a节律为主,实验组Ⅳ或Ⅴ级痫性发作时脑电图均出现典型的高波幅棘慢波、尖慢波。实验组海马各区nestin阳性星形细胞较对照组明显增多。结论：戊四氮点燃引起海马内nestin阳性星性细胞明显增加,提示癫痫脑组织内存在星形细胞增生和活化,这可能是癫痫脑组织胶质化及点燃维持的病理基础。     

叶酸对胎鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的探讨叶酸对体外培养的胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响。方法本研究采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养鼠胚大脑NSCs,用巢蛋白(nestin)免疫荧光染色对其进行鉴定,5'-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入法检测细胞增殖状态;设立正常对照组,叶酸低、高剂量(培养液中添加叶酸4.0 40 mg/L)和叶酸缺乏组(培养液中添加叶酸拮抗剂甲氨蝶呤0.4mg/L);通过nestin+BrdU免疫荧光双标记和绘制细胞生长曲线(MTT法)检测叶酸对细胞增殖状态的影响。结果无血清培养液中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞组成的神经球,BrdU免疫标记证实培养的NSCs具有增殖能力。免疫荧光双标记和MTT结果显示,两个叶酸干预组NSCs增殖能力较对照组显著增强。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs具有增殖和自我更新的能力;叶酸可以在一定程度上增强NSCs的增殖能力,促进神经干细胞的生长。