let-7在小鼠哮喘模型气道炎性反应中的作用及机制

目的 观察let-7家族微RNA抑制剂(anti-let-7)对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道炎性反应的影响,并探讨let-7参与哮喘形成的机制.方法 32只小鼠按随机数字法分为4组(n=8),即正常对照组(A组)、哮喘组(B组)、干预对照组(C组)和干预组(D组).其中B、C和D组用鸡卵蛋白(OVA)免疫,建立哮喘模型,A组以生理盐水替代OVA处理.D组小鼠激发前注射anti-let-7以抑制内源性let-7表达,C组小鼠注射乱序siRNA对照.比较各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞计数,肺组织中let-7e以及BALF中白细胞介素-10(IL-10)含量；体外用anti-let-7转染肺癌细胞A549,并检测细胞中let-7e表达和细胞培养上清中IL-10的含量；荧光素酶报告法检测let-7e是否直接靶向IL-10.结果 与A组相比,B组和C组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞数显著增加[(20.32±5.33)×109/L和(24.74±6.69)×109/L比(7.12± 1.88)×109/L,(6.45±2.5)×109/L和(7.12±2.66)×109/L比(0.04±0.01)×109/L,均P＜0.01]；肺组织中let-7e水平明显升高(分别为3.83倍和3.27倍,均P＜0.01).与C组比较,D组BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞数明显减少[(13.85±3.74)× 109/L比(24.74±6.69)×109/L,(2.15±1.13)×109/L比(7.12±2.66)×109/L,均P＜0.05]；肺组织中let-7e显著降低[(0.45±0.22)比(3.28±0.45),P＜0.01],同时BALF中IL-10水平明显升高[(4.68±0.85)比(1.70±0.29),P＜0.01].此外,在肺癌细胞A549 中转染anti-let-7,let-7e表达显著下降[(0.22±0.03)比(1.00±0.11),P＜0.01],同时培养上清中IL-10明显上升[(2.58±0.35)比(1.00±0.15),P＜0.01].体外let-7e过表达显著降低IL-10报告载体的荧光素酶活性[(0.59±0.06)比(1.00±0.03),P＜0.01],而对突变的IL-10报告载体没有抑制作用.结论 anti-let-7对哮喘小鼠气道炎性反应具有明显的抑制作用,其作用机制可能与let-7直接靶向并抑制IL-10有关.     

肺癌诊断相关miRNA标志物的筛选和验证

目的 获得肺癌组织和正常肺部组织中差异表达的miRNA用于肺癌的早期诊断.方法 首先运用miRNA芯片比较5对来自临床的正常肺部组织和肺癌组织,筛选差异性表达的miRNA,然后用荧光实时定量PCR进行鉴定.最后用ROC曲线分析评价特定miRNA标志物区分肺癌组织与正常肺部组织的能力.结果 miR-10b-5p和miR-199a-5p在肺癌组织中的相对表达量(2.76±0.71;2.05±0.38)显著高于肺部正常组织中的相对表达量(1.00±0.17;0.96±0.18),差异有统计学意义(t=2.40、2.56,P＜0.05).ROC曲线评价miR-10b-5p和miR-199a-5p区分肺癌组织和肺部正常组织的能力,曲线下面积(AUC)分别为0.731和0.672.两个miRNA联合区分肺癌组织和肺部正常组织的AUC为0.773,灵敏度为57.9％,特异性为94.7％.结论 miR-10b-5p和miR-199a-5p联合可作为候选肿瘤标志物组合用于早期肺癌诊断.     

微RNA-210抑制人退行性变髓核细胞自噬影响椎间盘退行性变

目的探讨微RNA-210(miRNA-210)对退行性变髓核细胞自噬的影响及其参与椎间盘退行性变(IDD)进程的可能机制。方法收集24例IDD患者(IDD组)和6例腰椎骨折患者(对照组)椎间盘组织进行分离,培养髓核细胞。通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测髓核细胞中miRNA-210的表达,通过单丹磺酰尸胺(MDC)染色和蛋白质印迹法检测细胞自噬水平。通过FQ-PCR或蛋白质印迹法检测过表达或抑制miRNA-210对细胞自噬和细胞外基质代谢的影响。通过生物信息学手段寻找miRNA-210与自噬相关的靶基因及miRNA-210的结合位点,并应用双荧光素酶报告实验验证。结果与对照组相比,IDD组髓核细胞中miRNA-210表达量增加,细胞自噬水平降低。过表达miRNA-210会抑制髓核细胞自噬,同时降低Ⅱ型胶原(ColⅡ)及蛋白多糖表达量,升高基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和MMP-13表达量。自噬抑制剂3-MA减弱miRNA-210对ColⅡ、蛋白多糖、MMP-3和MMP-13的调节作用。miRNA-210与自噬相关蛋白7(ATG7)存在结合位点,过表达miRNA-210通过沉默ATG7抑制细胞自噬,激活MMP-3和MMP-13,促进细胞外基质(ColⅡ和蛋白多糖)降解。结论在发生退行性变的椎间盘组织中miRNA-210表达量增加。过表达的miRNA-210可能通过直接作用于靶基因ATG7抑制细胞自噬,促进细胞外基质降解,推动IDD进程。     

microRNA的液体芯片检测方法

microRNA表达谱的检测需要精确、高通量和多重检测方法 ,液体芯片可通过编码微球结合探针的序列差异,来检测相应的microRNA序列。本文介绍了两代液体芯片背景的FlexmiR产品,其通过锁核酸,逐步降温和单链酶解来提升对microRNA检测的特异性,为临床科研microRNA的研究提供新的检测工具。     

miRNA-29c和miRNA-30b及其预测靶基因在子宫内膜中的表达

目的:检测子宫内膜和蜕膜组织中miRNA-29c和miRNA-30b及其预测靶基因的表达,探讨mi RNA-29c和mi RNA-30b在子宫内膜蜕膜化中的意义。方法:选取分泌期子宫内膜组织14例(分泌期组),正常妊娠早期蜕膜组织16例(早孕组)和自然流产蜕膜组织18例(流产组),利用实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)技术检测3组中mi RNA-29c和mi RNA-30b的表达量,以及候选靶基因血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(serum and glucocorticoid-inducible kinase 1,SGK1)和瘦素受体(leptin receptor,LEPR)的m RNA表达量,分析mi RNA-29c和mi RNA-30b表达与SGK1和LEPR的关系。结果:流产组中mi RNA-29c的表达量高于分泌期组,差异有统计学意义(P0.05)。3组mi RNA-30b的表达差异无统计学意义(P0.05);SGK1和LEPR在早孕组表达最高,流产组中表达最低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:mi RNA-29c的表达变化可能通过靶向SGK1参与子宫内膜蜕膜化。SGK1和LEPR在蜕膜中的差异表达对维持早期妊娠有一定的作用。     

基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎与病毒性脑膜炎诊断中的价值

目的: 评价基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)与病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)诊断中的价值。方法: 选取2017年12月至2019年9月在首都医科大学附属北京胸科医院和首都医科大学附属北京天坛医院治疗的TBM患者28例和VM患者27例作为验证样本进行实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证。选取前期收集的8例TBM患者和5例VM患者作为基因芯片样本进行全基因组miRNA微阵列分析,通过预测差异性miRNA的靶基因、基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络筛选出两病间前10个差异性miRNA枢纽基因。再采用qRT-PCR对患者间表达差异明显的miR-21-5p进行验证,并通过受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析miRNA的诊断价值。结果: 通过miRNA微阵列分析初步筛选出26个差异表达的miRNA(14个表达上调,12个表达下调)和对应的靶基因3217个。经GO富集分析、KEGG信号通路分析筛选出190个相关靶基因,对其进行PPI网络分析,筛选出前10个靶基因作为核心靶基因。对基因芯片检测样本的hsa-miR-21-5p相对表达量进行qRT-PCR验证,发现TBM患者hsa-miR-21-5p的表达水平[15.890(3.423,25.581)]较VM患者[0.807(0.614,0.955)]明显上调(Z=-2.355,P=0.019),差异倍数(TBM/VM)在基因芯片和qRT-PCR中分别是4.817和4.660,两种检测方法结果基本一致;对28例TBM和27例VM患者的hsa-miR-21-5p进行qRT-PCR结果比较,发现hsa-miR-21-5p在TBM患者的相对表达量为4.825(2.433,21.362),明显高于VM患者[0.204(0.112,0.711)],差异有统计学意义(Z=-5.000,P=0.000),且ROC曲线区分TBM与VM患者的AUC为0.893(0.806~0.980),敏感度为85.7%,特异度为88.9%。结论: 相较于VM患者,作为基因芯片检测中表达差异明显的miR-21-5p在TBM患者中表达明显上调,可作为鉴别TBM与VM的潜在生物标志物。     

胰腺癌中miR-27a靶基因PSMA1的预测及鉴定

目的 软件预测并筛选miR-27a可能的靶基因,结合胰腺癌比较蛋白质组学结果中表达下调的蛋白,进一步检测胰腺癌中miR-27a的靶基因并进行验证.方法 采用生物信息学预测软件TargetScan、PicTar以及miranda预测miR-27a的靶基因,结合前期比较蛋白质组学的结果,筛选出miR-27a的可能靶基因;构建靶基因3'非翻译区(UTR)的表达载体,双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-27a对靶基因的靶向作用;胰腺癌肿瘤细胞系PANC-1和BxPC-3中转染miR-27a mimics或微小RNA阴性对照序列,Western blot检测靶蛋白的表达情况.结果 软件预测与蛋白质组学分析结合筛选出miR-27a的靶基因为PSMAl.双荧光素酶报告基因检测系统显示,与对照组相比miR-27a对野生型PSMA1的3'UTR具有靶向作用,实验组较阴性对照组相对活性值下降19.14％,差异具有统计学意义(P=0.016);而对突变型PSMA1 3'UTR的靶向作用消失,实验组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P=0.249).Western blot分析显示转染miR-27a mimics组PSMA1蛋白的相对表达量明显低于阴性对照组,PANC-1细胞实验组的PSMA1相对表达量为0.71±0.01;BxPC-3细胞实验组的PSMA1相对表达量为0.58±.0.04,P值均＜0.01.结论 胰腺癌中PSMA1是miR-27a的直接靶基因.