深低温冷藏并戊二醛化同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点评价

背景：采用不同方法处理的异体肌腱移植修复手外伤肌腱缺损，已成为近年手部组织工程研究的重点。目的：探讨经深低温冰箱冷藏及戊二醛处理的同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点。设计：自身前后对照观察。单位：惠州市中心人民医院骨科病房。对象：选择1997—01／2001—08在惠州市中心人民医院骨科二病区住院的男性手外伤肌腱缺损患者15例（17条肌腱），年龄20～35岁。其中伸指肌腱缺损8条，屈指肌腱缺损9条；缺损肌腱长3-9cm。方法：应用从健康青壮年意外死亡者志愿贡献或外伤断肢后无再植条件废弃肢体经无菌操作条件取出的手指屈肌腱（本人或家属均知情同意），经-80℃深低温冰箱保存，术前应用3．5g/L戊二醛溶液浸泡后按显微外科缝合肌腱的方法将异体肌腱移植于手部肌腱缺损处。随访时按国际手外科联合会制定的总活动度法评定疗效，分为优、良、可、差4级。主要观察指标：手指总主动活动度和排斥反应。结果：15例患者（17条肌腱）均进入结果分析。随访8个月，手指肌腱总活动度优级4条，良级6条，可级4条，差级3条，总有效率82．36％（14／17）。全部病例没有使用激素及免疫抑制剂，均没有发生急性免疫排斥反应，移植的肌腱无断裂。结论：异体肌腱经-80℃深低温保存及术前应用戊二醛处理，可以降低移植后的抗原反应，增加移植肌腱的强度和韧性，避免可能发生的传染病的感染，是代替自体肌腱移植的良好方法之一，但移植后存在着肌腱粘连的并发症尚需解决。     

骨组织低温保存技术的特点

工程组织和生物活体器官的低温保存是当今生物医学工程最前沿的研究课题。组织较细胞结构更为复杂,传热传质难以控制。细胞与材料的黏附是影响骨组织成功保存的重要因素,玻璃化低温保存是实现骨组织成功保存的重要方法,另外还应积极寻找其他能够有利低温保存的外界因素,如压力,微波等。到目前为止,器官的低温保存没有取得大的突破,但相信,随着科学实验和技术的发展,研究各类细胞、组织、器官的低温耐受性和生物材料传热规律的成熟,寻找减轻损伤的技术,最终会实现器官的低温保存。     

深低温保存新鲜富含血小板血浆质量分析

为了评价批量制备的深低温保存富含血小板血浆(cryo-FPRP)的效率和效果,在优化建立的无偿献血者血小板的批量分离和制备cryo-FPRP过程中测定了ACD抗凝的200ml全血、FPRP、含5%DMSO的FPRP(DM-SO-PRP)和-80℃冰箱然冰冻保存后复温的FPRP(Cryo-FPRP)的血小板计数(Plt)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血浆内pH、血浆乳酸(LA)浓度和乳酸脱氢酶(LDH)浓度、细菌培养、血小板CD62p阳性率、PAC-1阳性率及抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度,也测定了FPRP和cryo-FPRP的促凝血活性.结果表明①血小板的总平均得率为70%;FPRP中残余的红细胞≤1×109/袋;白细胞≤1×107/袋.②血浆pH、LA浓度和PAC-1阳性率在整个制备和保存过程中没有明显变化.③血浆内LDH、血小板CD62p阳性率和血小板抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度在血小板冰冻保存后出现明显升高.④与FPRP比较,cryo-FPRP诱导的血浆凝固时间明显缩短.结论①本研究选择的离心分离制备FPRP条件可高效分离无偿献血者的血小板,同时不会导致血小板激活率增加.②深低温保存无偿献血者的新鲜富含血小板血浆可有效防止代谢产物的积累和pH下降,并且可以高效预防血小板GPⅡb/Ⅲa的激活.③冰冻保存后部分血小板胞膜受到明显损害.④血小板胞膜表面GpIb-Ⅸ-Ⅴ复合物的数量增加,促凝血活性明显增强.     

肌腱玻璃化法冷冻保存的体外实验

目的:目前临床上常用低温冷冻法来保存同种异体肌腱,但操作较复杂费时,并且所保存的肌腱活性较低而限制其应用。采用已筛选的玻璃化法冷冻保存鸡屈趾深肌腱,并将复温后的玻璃化肌腱进行体外检测,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成。①实验材料及分组:来亨鸡16只,雄性,体质量2.5kg左右,随机分为2组,玻璃化组为玻璃化肌腱,新鲜肌腱组为新鲜肌腱,每组8只。②实验过程:切取来亨鸡屈趾深肌腱,置入玻璃化液内快速投入液氮保存2周制备玻璃化肌腱。③实验评估:将2组肌腱在体外进行大体、组织学及超微结构观察,羟脯氨酸含量测定,生物力学性能检测,并对两组肌腱进行细胞培养与鉴定。结果:①玻璃化组肌腱的大体、组织学及超微结构与新鲜肌腱组相似,其细胞及细胞外结构得以良好保存。②应用碱解法测定玻璃化肌腱内的羟脯氨酸含量为69.27mg/g,与新鲜肌腱组间差异无统计学意义。③玻璃化组肌腱破裂强度为165.58MPa,弹性模量1.41GPa,与新鲜肌腱组的力学性能差异无统计学意义。④将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,其生物学特性与新鲜肌腱组相似。⑤将两组肌腱培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞。结论:玻璃化法保存的肌腱具有良好的细胞活性、细胞外结构及力学性能,其生物学及生物力学特性无明显变异。     

依达拉奉对深低温保存大鼠断肢再植后缺血再灌注损伤的影响

目的:观察依达拉奉对深低温保存大鼠断肢再植后出现缺血再灌注损伤时的保护作用。方法:实验于2006-04/11在山东省立医院手足外科低温医学实验室完成。①选取健康成年Wistar大鼠36只,随机分为对照组、冷冻组和依达拉奉组3组,每组12只。②对照组只显露股动静脉而不结扎,其他2组大鼠截断右后肢,对断肢进行深低温冷冻保存处理(自结扎股动静脉至深低温保存约2h)。③1个月后,将冷冻保存的断肢复温、灌洗液洗脱,依达拉奉组所用灌洗液中含依达拉奉0.5mg/kg,行自体肢体回植(自液氮中取出肢体至恢复血供约2h),恢复肢体血供4h后取材,骨骼肌丙二醛含量,超氧化物歧化酶活性以及线粒体ATP酶活性,测定胫前肌含水量,光镜观察各组骨骼肌肌组织的结构改变。结果:36只全部进入结果分析。①骨骼肌丙二醛含量:依达拉奉组低于冷冻组[(10.37±1.25),(15.36±1.28)μmol/g,P<0.01]。②骨骼肌ATP酶和超氧化物歧化酶活性:依达拉奉组高于冷冻组[(206.2±45.2),(72.7±32.5)μkat/g;(83.9±5.2),(70.5±8.0)mkat/g;P均<0.01]。③胫前肌湿/干质量比值:依达拉奉组低于冷冻组(4.89±0.82,6.38±0.63,P<0.01)。④光镜结果显示依达拉奉组骨骼肌损伤程度明显轻于冷冻组。结论:依达拉奉可以降低肢体再灌注后肌肉组织中的氧自由基水平,减轻缺血再灌注对骨骼肌造成的损伤,对缺血再灌注骨骼肌具有保护作用。     

组织工程皮肤构建中胎儿皮肤标本玻璃化冻存的实验

目的：建立一种用于细胞培养的皮肤标本新的保存方法。 方法：实验于2004-05-01／2-31在第四军医大学西京医院烧伤外科实验室进行。①分别取流产胎儿头部及躯干部全层皮片（家属知情同意），按照标本保存方法不同分为常规组（4℃保存2h）、冻存1组（-196℃液氮保存1周组）、冻存2组（-196℃液氮保存1个月组）和冻存3组（-196℃液氮保存6个月组）。采用抗冻液4℃下预处理20min后直接快速置于-196℃液氮中的玻璃化冻存方法进行冻存。②分别进行胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的原代培养，进行细胞形态学观察，并采用锥虫蓝染色法、四唑盐比色法和克隆形成实验观察培养的第2代角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的活力。 结果：①与常规组同种细胞相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组的胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的形态学特点基本相同。②与常规组相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞活细胞率、细胞存活率及克隆形成率差异均无显著性意义（P〉0．05）。 结论：利用液氮玻璃化保存用于细胞培养的皮肤标本不会影响细胞活力，是保持组织活性的一种有价值的组织标本保存方法，对组织工程皮肤的建立，乃至构建组织细胞库有着重要意义。     

X-J心脏保存液对离体心脏不同保存时限ATP及超微结构的影响

目的 :探讨XIJING (X J)超极化保存液对离体兔心低温下不同保存时间再灌注 3 0min后心肌细胞ATP含量及心肌超微结构的影响。方法 :健康大白兔 3 2只 ,随机分成 4组 ,每组 8只 ,Ⅰ组 :低温保存 4h ;Ⅱ组 :低温保存 6h ;Ⅲ组 :低温保存 8h ;Ⅳ组 :低温保存 10h。每组供心均用X J超极化心肌保存液进行低温保存。测定再灌注 3 0min心肌细胞ATP含量及心室肌超微结构 ,比较不同保存时间再灌注后心肌细胞ATP及心肌超微结构的变化。结果 :随着低温保存时间的延长再灌注 3 0min后心肌细胞内ATP的含量无明显的差异 (P >0 0 5 )。从电镜观察来看 ,兔心保存 4～ 6h时心肌纤维排列尚整齐 ,线粒体轻度肿胀 ;在保存 8h后心肌纤维排列紊乱 ,线粒体嵴肿胀 ,个别线粒体出现空泡化 ;10h时心肌组织出现部分心肌细胞坏死 ,细胞器散在于细胞间。结论 :X J超极化心脏保存液在低温保存供心 4～ 6h心肌超微结构变化不明显 ,心脏保存 10h后心肌超微结构改变较 8h明显。     

不同冻存液改善人胎肝细胞冻存质量比较

目的：通过对不同冻存液冻存人胎肝细胞进行比较,探索一种效果较好的冻存液以改善冻存肝细胞质量.方法：实验于2004-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成.采用二步灌注法分离人胎肝细胞,将分离后的胎肝细胞分别以3组不同冻存液（HAMF-12,RPMI-1640,DMEM）在液氮中冷冻保存4周.4周后快速复苏胎肝细胞,进行存活率、形态学及尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量检测.结果：①HAMF-12组生存率为（86.0&;#177;2.4）%,明显优于RPMI-1640组（81.9&;#177;6.5）%和DMEM组（82.1&;#177;4.6）%.②HAMF-12组肝细胞极性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,少数细胞内出现空泡,与对照组肝细胞形态相似.③用HAMF-12组液冻存人胎肝细胞复苏后,尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量优于RPMI-1640组和DMEM组.结论：①在其他冻存条件相同下,HAMF-12冻存液显著提高了人胎肝细胞冻存质量,优于RPMI-1640液、DMEM液.②复苏后HAMF-12组肝细胞形态学光镜下观察与刚分离的肝细胞无明显差异,进行原代培养后肝细胞极性恢复较好.     

Adenosine 5＇triphosphate transport and accumulation during the cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin solution

AIM: We used isolated hepatocytes to investigate how different concentrations of ATP in the University of Wisconsin (UW) solution affected both cellular ATP content and cell viability during the cold storage and the rewarming step. The mechanism involved in ATP transport and accumulation in hypothermia was also determined. METHODS: The cells were preserved up to 72 h in different conditions: UW solution without ATP (a-group), UW+5 mmol/L ATP (b-group), and UW+10 mmol/L ATP (c-group). The ATP content and the cell viability (LDH release) were determined during the cold storage and the rewarming step. In the groups a and c, the respiratory function of the cells at rewarming was studied. In addition, the cell volume of hepatocytes and the mechanism involved in ATP transport and accumulation were assessed. The extracellular degradation of exogenous nucleotides during transport experiments was investigated by a HPLC technique. RESULTS: After three days of cold storage a loss of cellular ATP content was observed in hepatocytes preserved either without nucleotides (a-group) or with 5 mmol/L ATP (b-group). In contrast, 10 mmol/L ATP (c-group) was able to maintain a normal ATP cellular content, with only a 6% diminution after 72 h of cold storage. The respiratory function was significantly different in hepatocytes preserved with 10 mmol/L ATP than without ATP. No significant change was detected For the three groups in cellular volume during the cold storage. We also report that the time course accumulation of [3H]-ATP by cold stored hepatocytes is a rapid process that is completed after 180 s with linear dependence on the extracellular ATP concentration (linear fitting results in a slope of 0.5624±0.1179 mmol/L ATP intracell/mmcl/L ATP extracell). CONCLUSION: Our results show that, during hypothermic storage in UW solution, hepatocytes are permeable to ATP by a diffusive mechanism. Also, we found that it is ATP the main extracellular nucleotide available for transport and it is not the breakdown products.     

人动脉的低温-深低温序贯保存

目的 通过观察低温及深低温保存后移植血管的细胞代谢活性及组织结构变化情况,探讨低温-深低温序贯保存人体血管的可行性与安全时限. 方法 取人的髂动脉和脾动脉,于4℃UW液中分别保存72 h、1周、2周、3周和4周,得到的血管一部分分别行氯化硝基四氮咗蓝(NBT)染色和HE染色.另一部分继续于-80 ℃下深低温冻存4周,复温后分别行NBT染色和HE染色,光镜及电镜下观察血管组织和细胞结构变化. 结果 冷保存2周时的血管NBT染色时间的差异无统计学意义(P＞0.05);冷保存后1周,冻存前后的染色时间的差异无统计学意义,冻存者的染色时间与新鲜血管比较,差异也无统计学意义(P＞0.05).随着4℃冷保存时间的延长,血管组织结构的破坏加重,当保存时间超过2周时.血管损伤更加明显及严重;4℃下保存越久的血管,再行-80℃冻存后其超微结构破坏越重,当4℃下保存时间超过1周时,血管损伤更加明显及严重. 结论 4℃UW液冷保存人体动脉的安全时限为2周;4℃UW液冷保存1周以内的血管再行-80℃深低温冻存,其细胞代谢活性与组织结构保持良好.