柯萨奇B组3型、5型病毒在人脐静脉血管内皮细胞中持续感染模型的建立

柯萨奇B组病毒 (groupBcoxsackieviruses ,CVB)可引起人类多种疾病。如病毒性心肌炎 ,有的患者可转为慢性 ,晚期形成扩张型心肌病 ,导致心衰 ,预后不良。目前认为扩张型心肌病的病因与病毒在心肌组织中的持续存在有关〔1〕。CVB可形成病毒血症 ,侵入血管内皮细胞或经血管内皮细胞穿越内皮屏障 ,感染相应靶组织。ECV30 4为一株自发突变为可传代的人脐静脉内皮细胞 ,其主要生物学特性与原代细胞相似。本研究在ECV30 4细胞中建立CVB3、CVB5持续感染的细胞模型 ,通过对病毒、细胞各种指标的检测 ,印证病毒长期存在于感染细胞中。为病毒…     

重组蛋白生物制品灌流培养工艺及药学评价考量

灌流培养作为一种连续细胞培养技术,较传统批量生产工艺有利于企业生产成本控制,并可根据供应需求灵活调整规模。本文对比了传统批量发酵工艺与灌流工艺,明确了灌流培养工艺特点。结合国际人用药品注册技术协会目前正在起草的指导原则,本文从细胞传代稳定性研究、批次及规模定义、生产工艺控制、外源因子控制、生产工艺验证等方面,总结了灌流培养工艺药学评价的考量内容。     

3株抗菌药物活性评价用标准菌株的建立与评价

目的 参照《病原微生物菌(毒)种国家标准菌株评价技术标准》(WS/T 812-2022),在实验室条件下对保藏于中国医学科学院病原微生物菌(毒)种保藏中心药用微生物相关菌(毒)种保藏分中心的大肠埃希菌CCPM(A)-P-000101、肺炎克雷伯菌CCPM(A)-P-000102、金黄色葡萄球菌CCPM(A)-P-000100菌株,分别测定病原微生物学特征,推动这3株细菌成为抗菌药物活性评价中使用的标准株。方法 进行菌落形态和革兰染色观察,根据生化鉴定、抗生素敏感性测试、16S rDNA测序,以及多次传代后,观察和比较不同代次间细菌生长、药敏特性以及感染实验动物的100%最小致死量的差别,了解3株细菌的传代稳定性,明确其病原微生物学特征。结果 菌落形态、革兰染色、生化鉴定、16S rDNA测序结果证明CCPM(A)-P-000101、CCPM(A)-P-000102、CCPM(A)-P-000100菌株具备大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌对应的典型特征,除对青霉素、氨苄西林等少数抗生素具有耐药性,3株细菌对多数受试抗生素具有敏感性表型。3株细菌的G10菌株与G1菌株比较,生长曲线...     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

干细胞因子和粒细胞集落刺激因子联合动员小鼠外周血培养间充质干细胞的生物学特性

目的:粒细胞集落刺激因子和干细胞因子是血细胞生成过程中的两个重要细胞因子,由于两者协同作用通过细胞内信息传导改变或阻断干细胞的黏附分子表达,增加其数量并抑制细胞凋亡,改变骨髓间充质干细胞功能.联合利用两者动员小鼠外周血,培养间充质干细胞,并探讨在体外单层培养条件下向软骨细胞方向诱导的条件.方法:实验于2005-01/2006-03在河北医科大学第四医院科研中心河北省重点实验室完成.①实验材料:BALB/C小鼠,4～6周龄,雄性,体质量15～20 g,由河北医科大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:利用密度梯度离心结合贴壁法,从经粒细胞集落刺激因子和干细胞因子动员后的BALB/C小鼠外周血分离培养间充质干细胞,取生长良好的细胞进行克隆形成能力检测,并应用流式细胞分析结合免疫组化方法鉴定.同时利用含有转化生长因子β1的高糖DMEM培养液诱导第3代间充质干细胞向软骨细胞分化,应用免疫组织化学方法检测Ⅱ型胶原表达情况.结果:①从外周血培养出的间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞表型相似,并可以向软骨细胞分化.流式细胞分析结果显示,细胞表达相关的抗原标记CD29和CD44,不表达造血细胞系的表面标志CD34和CD45.②免疫组织化学显示,第3代间充质干细胞Ⅱ型胶原、层黏连蛋白表达为阴性,波形蛋白为阳性.诱导后的间充质干细胞Ⅱ型胶原表达为阳性.③P1、P3、P5 3代细胞的克隆形成率不同,两两比较显示随着代数的增加,克隆形成率逐渐降低（21.32%,16.13%,9.63%,P<0.01）.结论:经干细胞因子和粒细胞集落刺激因子动员后的外周血中可以得到一定数量并且纯度较高的间充质干细胞,细胞在体外生长较活跃,并在特定培养液的诱导下可以向软骨细胞表型转化,但细胞传代次数较低.     

狂犬病毒疫苗株CTN-1八代次N和G基因序列测定及分析

目的测定八个代次CTN-1疫苗株核蛋白（N）和糖蛋白（G）基因序列，并与代表性疫苗株和街毒株进行比较。方法用RT-PCR反应扩增八代次CTN-1的N和G基因，获得cDNA，进行序列测定。结果八个代次CTN-1的N和G基因序列与其它疫苗株比较，核苷酸的同源性分别为82．7％～84．5％和86．6％～88．5％，氨基酸同源性分别为88．9％～92．5％和95．3％～98．2％；与在我国分离的街毒株相比，核苷酸的同源性分别为84．2％～95．0％和80．4％～94．3％，氨基酸同源性分别为92．1％～99．6％和88．7％～98．5％。CTN-1株八个代次之间的核苷酸序列几乎完全相同。结论CTN-1株在传代过程中N和G基因变异小，与中国流行的代表性街毒株的同源性高于其它疫苗株。     

构建P16慢病毒载体永生化心肌干细胞的探讨

目的：构建P16慢病毒载体,为修复坏死心肌干细胞提供理论基础。方法构建 pLVX p16ink4a ZsGreen、pLVX P16INK4a慢病毒载体,将P16目的基因转导入目标细胞。利用倒置免疫荧光显微镜观察携带绿色荧光蛋白的 pLVX p16ink4a ZsGreen阳性转导细胞的变化,并通过β半乳糖苷酶染色鉴定观察 pLVX P16INK4a 转导阳性细胞即衰老细胞的变化。利用Western blotting法测定P16目的基因转导成功后蛋白变化水平。结果携带绿色荧光蛋白的 pLVX P16ink4a ZsGreen阳性转导细胞传代增殖受到抑制,β半乳糖苷酶染色鉴定观察 pLVX P16INK4a转导阳性细胞即衰老细胞增殖受到抑制,上述两种阳性转导细胞在细胞培养传代过程中被稀释。Western blotting法测定p16INK4a蛋白水平也存在稀释变化。结论构建P16慢病毒载体转导目标细胞传代培养过程中,目的基因P16在细胞传代增殖过程中存在抑制作用,并可导致转导阳性细胞稀释。     

P>培养时间和传代次数对山羊输卵管上皮细胞周期和凋亡的影响/P>

目的 利用山羊输卵管上皮细胞(OECs)探讨体外培养时间和传代次数对细胞生长的影响.方法 建立山羊OECs的体外培养体系,用流式细胞术分别对半数贴壁、刚贴满(贴壁1d)、贴满3d和贴满5d,以及原代、Ⅲ代和Ⅴ代细胞分别进行细胞周期和凋亡检测.结果细胞贴满3d和传至Ⅲ代时,细胞凋亡比率较低,处于静止期(G0/G1)细胞明显降低,极性线粒体受损明显降低;培养时间延长和传代次数增加后,凋亡比率显著升高,处于增殖期(S,G2/M)的比率显著降低,极性线粒体受损明显升高.结论采用OECs培养胚胎时,细胞应控制在Ⅲ代以内,且贴满时间不超过3d.     

高密度细胞培养对兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的作用

背景: 软骨细胞体外培养时常发生失分化,合成糖胺多糖的能力下降,延缓软骨细胞的失分化速度是组织工程学需要解决的重要课题。目的：观察不同接种密度下,软骨细胞合成糖胺多糖的能力。设计、时间及地点：对比观察细胞学实验,于2007-01/05 在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：1月龄新西兰兔5只。方法：采用0.4% Pronase酶和0.025% Ⅱ型胶原酶消化分离双膝关节关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分,一部分以2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种。另一部分在细胞贴壁后,人工降低细胞密度至2×103/cm2培养。倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况。原代和传1代细胞于细胞融合后换液。 主要观察指标：换液后12,24,36,48,60 h以改良Alcian blue 染色沉淀法测定糖胺多糖质量浓度。结果：原代高密度培养组关节软骨细胞为多边形,轮廓清晰,三四天即可见集落形成,集落周边细胞较中心瘦长,为长多边形,传1代细胞形态无明显变化。低密度培养细胞早期散在分布,7 d左右形成集落,细胞形态与高密度培养无明显差异。原代低密度培养软骨细胞长到融合所需时间较原代高密度培养细胞所需时间长。原代低密度培养组上清液中糖胺多糖质量浓度显著低于原代及传1代高密度培养组软骨细胞(P < 0.001,P < 0.05),且时间越长,质量浓度相差越大。　结论：与低密度培养相比,平面高密度培养可提高软骨细胞合成糖胺多糖的能力,明显减缓软骨细胞的失分化速度,提示高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式。     

细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响

目的：观察在成软骨诱导培养条件下，细胞传代对骨髓问充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响。方法：不同代MSCs成软骨诱导后，观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、RT-PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况。结果：经成软骨诱导后，第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高。结论：MSCs很可能由多种形态功能接近，分化潜能有略有差异的细胞组成；在成软骨诱导培养条件下，对此传代后成软骨能力减弱。