酵母朊蛋白Sup35NM体外淀粉样纤维的形成动态研究

目的 研究酵母朊蛋白Sup35在近似于生理环境的体外条件下淀粉样纤维形成的动态过程，为阐明淀粉样纤维的形成机制提供材料和线索。方法 在E．coli中表达Sup35蛋白的NM段，并用Ni^2＋螫合层析对重组蛋白在变性条件下进行纯化，在不同的时间点用透射电子显微镜观察、圆二色谱检测以及蛋白酶K消化试验，同时利用硫黄素（thioflavin T，ThT）结合试验对淀粉样纤维形成的动态过程进行检测。结果 在变性条件下成功纯化出Sup35NM重组蛋白。利用透射电子显微镜观察到了Sup35NM蛋白在PBS（pH7．4）缓冲液中发生聚集时的形态变化，圆二色谱检测显示该过程伴随蛋白结构由α-螺旋到β-折叠的转变。纤维具有较强的抗蛋白酶K消化的特性。ThT结合试验提示淀粉样纤维的形成在经过了一个快速的上升阶段后达到平台期，纤维形成的速率会随着蛋白浓度的提高而加快。结论酵母朊蛋白Sup35NM在接近生理环境的体外条件下极易发生聚集，聚集物具有淀粉样纤维性质，Sup35NM淀粉样纤维形成的动态过程为淀粉样变成核聚集模型的研究提供了依据。     

18S rRNA基因序列分析在临床常见酵母样真菌鉴定中的应用

目的 应用18S rRNA基因序列分析技术对临床分离的常见酵母样真菌进行种的分类鉴定,且与传统方法比较,分析基因序列分析法鉴定临床常见酵母样真菌的可行性.方法 收集北京同仁医院微生物室菌库酵母样真菌115株,提取的DNA用18S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物直接测序,测序结果提交GenBank通过核酸序列比对对微生物种属进行鉴定,同时进行真菌显色培养基鉴定、Vitek 32 YBC鉴定,比较3种不同方法鉴定酵母样真菌的种鉴定准确率,阐明应用基因序列分析法鉴定临床酵母样真菌的可行性.结果 18S rRNA基因序列分析法与表型鉴定法相比较,有13株酵母样真菌鉴定结果存在差异:显色培养基仅鉴定出102株,与基因序列分析鉴定的符合率为89.2%(91/102),Vitek 32 YBC鉴定结果与基因序列分析鉴定的符合率为91.3%(105/115);显色培养基、Vitek 32 YBC和18S rRNA基因序列分析鉴定到种的比例分别为88.7%(102/115)、100%(115/115)、100%(115/115).结论 18S rRNA基因序列分析法呵对常见酵母样真菌进行准确分类.     

Evaluation of the "Yeast-IDENT System" for the Identification of Medically Important Yeasts./Bewertung des "Yeast-IDENT-Systems" zur Identifizierung medizinisch wichtiger Hefen

Summary: Ninety-one coded cultures belonging to nine genera of medically important yeasts were used to evaluate the newly marketed “Yeast-IDENT” (Y-I) system for identification. The results were compared with conventional procedures which included microscopic morphology, carbohydrate assimilation and fermentation tests, other nutritional tests, and/or API 20C. The Y-I system identified isolates of Candida albicans, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. pseudotropicalis, Cryptococcus albidus, Cr. neoformans, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Sporobolomyces salmonicolor, Torulopsis candida and T. glabrata with 100% accuracy. With the Y-I system, other species identified with variable degree of accuracy (50–89%) included C. krusei, C. parapsilosis, C. rugosa, C. tropicalis, Cr. laurentii, Hansenula anomala and Trichosporon beigelii. One isolate each of Cr. luteolus, Cr. terreus and Prototheca wickerhamii (an achlorophyllous alga) were not identified with the Y-I system. Overall accuracy of the Y-I system was 87.2% when compared with the conventional and/or API 20C. The Y-I system is rapid and requires only 4h of incubation at 35–37°C compared with 72h to 14 d necessary for the other two procedures. Zusammenfassung: Einundneunzig verschlüsselte Kulturen von neun Genera medizinisch wichtiger Hefen wurden zur Bewertung eines neuen »Yeast-IDENT«-(Y-I)-Systems für die Hefeidentifizierung verwendet. Die Resultate wurden mit konventionellen Methoden unter Einschluß der mikroskopischen Morphologie, der Kohlenhydratassimilation und -fermentation sowie anderer Verwertungsteste und/oder mit dem API 20 C-System verglichen. Das Y-I-System identifizierte Isolate von Candida albicans, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. pseudotropicalis, Cryptococcus albidus, Cr. neoformans, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Sporobolomyces salmonicolor, Torulopsis candida und T. glabrata mit 100%iger Genauigkeit. Andere Hefearten wurden mit dem Y-I-System in unterschiedlichem Ausmaß (50–80%) erkannt, darunter C. krusei, C. parapsilosis, C. rugosa, C. tropicalis, Cr. laurentii, Hansenula anomala und Trichosporon beigelii. Je ein Isolat von Cr. luteolus, Cr. terreus und Prototheca wickerhamii (einer chlorophyllfreien Alge) wurden mit dem Y-I-System nicht identifiziert. Die Gesamtgenauigkeit des Y-I-Systems lag bei 87,2%, verglichen mit den konventionellen Methoden und/oder API 20 C. Das Y-I-System ist schnell und erfordert nur 4 h Bebrütungsdauer bei 35–37°C im Vergleich zu 72 h bis 14 d, die bei den beiden anderen Methodiken benötigt werden.     

Die Bedeutung zentraler Venenkatheter bei der Entstehung von Candida-Endomykosen: The Significance of Central Venous Catheters for the Rise of Deep-seated Candidosis

A high concentration of yeasts in feces creates the possibility of active penetration of yeast cells into the surrounding tissue and thereby into blood vessels. Fungaemia is probably caused by this process more often than generally suspected. It is our opinion that venous catheters are contaminated very rarely by yeasts residing on the skin and it is more likely that fungaemia is the causative mechanisms. Adhesion of Candida albicans cells to the catheter wall could not be demonstrated in these investigations. The catheter material examined had no fungistatic properties. To prevent catheters becoming a secondary source of infection it would be advisable for manufacturers to add fungistatic substances to the plastic material of venous catheters.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

细菌激活系统血液免疫反应仿真自然体系实验研究

目的：用现代系统免疫学仿真自然体系探讨血液细菌感染的系统血液免疫反应状况。方法：将酵母菌及灭活卡介苗（5×10^8／mL）0．2mL分别激活全血0．2mL或WBC 0．2mL和血浆（或0．9％氯化钠溶液）0．3mL，37℃水浴1h，用流式细胞仪法（FCM）、ELISA等方法观察IL-8含量，补体C3、C4和趋化因子受体Fy6的变化。结果：在血浆存在的条件下，细菌可激活RBC调控和促进WBC产生IL-8，使自然实验组IL-8激活指数（37．04±34．84）明显高于WBC激活分离实验组IL-8激活指数（1．09±0．77），而且前者补体叫增值（0．0100±0．0100）也明显高于后者（-0．0027±0．0080），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：酵母菌及灭活卡介苗在血液中先被补体系统识别、激活，绝大部分附有C3b的细菌被红细胞黏附；提呈给WBC后，町引发血浆免疫反应、RBC免疫反应、吞噬细胞免疫反应和淋巴细胞免疫反应。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A与钙离子信号调节亲环素配体的相互作用

目的 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A（HCV NS4A）与钙离子信号调节亲环素配体（CAML）的相互作用。方法 对CAML编码基因进行克隆，并构建其酵母表达载体，在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后，构建HCV NS4A及CAML真核表达载体，转染293细胞，行免疫共沉淀实验及Western印迹检测。结果 成功克隆CAML基因，并构建CAML的酵母表达载体，在酵母细胞中回交验证HCV NS4A与CAML的相互作用，构建HCV NS4A及CAML的真核细胞表达载体，并利用免疫共沉淀技术验证了两者的相互作用。结论 CAML与HCV NS4A的相互作用可能对HCV感染细胞的钙离子浓度、细胞凋亡等生物过程产生影响，从而在HCV感染慢性化过程中发挥作用。     

酵母样真菌酶反应模式的初步建立

利用尿素底物和１８种带有显色基团的合成底物，对４属１４种１５６株酵母样真菌进行酶活性测定，初步建立了酵母样真菌酶反应模式。结果表明所试１４种菌各有其特异的酶反应模式。酶法鉴定具有快速、准确、简便等优点，是今后临床实验室常规酵母样真菌鉴定具有潜在发展前景的方法。我们建立的酶反应模式如做进一步充实和完善后，可以作为标准反应模式用于临床菌株的快速鉴定。