老年湿疹患者T辅助细胞相关细胞因子水平分析

目的 研究老年湿疹患者Th1/Th2细胞因子的血清水平与湿疹的发展及其临床表现的相关性. 方法 应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定50例老年湿疹患者(≥60岁)白介素(IL)-2、4、10、12和肿瘤坏死因子(TNF-α)的血清水平并与34例健康老年人(对照组)进行比较;比较急性和慢性,或泛发性和局限性湿疹上述细胞因子的水平差异. 结果 老年湿疹组IL-2 [(16.03±0.47)比(15.72±0.33) μg/L]、IL-4 [(14.04±0.56)比(13.56±0.16)μg/L]、IL-10[(33.01±5.40)比(29.49±1.07) μg/L]、IL-12 [(39.32±3.54)比(37.93±1.17) μg/L]和TNF-α [(27.33±0.72)比(26.38±0.48) μg/L]水平均高于对照组(t/t'=3.55,5.74,4.4 9,2.58,6.69,均P＜0.05).急性湿疹组血清细胞因子水平均高于对照组(t/t'=3.59,6.44,4.68,3.35,2.00,均P＜0.05);慢性湿疹组中IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的血清水平高于对照组(t'=2.46,5.50,3.83,3.10,均P＜0.05),而IL-12水平与对照组的差异无统计学意义(t'=1.77,P＞0.05);急性与慢性湿疹患者血清细胞因子的水平差异无统计学意义(P＞0.05).泛发性与局限性湿疹患者血清IL-2、II4、IL-10和IL-12、TNF-α的水平差异无统计学意义(t=0.18,5.74,4.49,0.91,0.25,1.11,均P＞0.05). 结论细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、Th1/Th2和TNF-α可能与老年人湿疹发生相关,不同临床类型的老年湿疹患者可能并无特定的Th1/Th2细胞因子变化模式.     

STAT5基因沉默对支气管哮喘小鼠T细胞增殖的影响

目的 探讨STAT5a/b基因沉默对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠T细胞增殖功能的影响.方法 将20只雌性BALB/c小鼠按随机数字法分为正常组和哮喘组,哮喘组按处理因素不同分别分为空白对照组、STAT5a沉默组、STAF5b沉默组及错义链对照组,采用免疫磁珠法筛选出正常及哮喘模型小鼠的脾脏T细胞,利用RNA干扰(RNAi)沉默T细胞内STAT5a/b基因.荧光定量PCR检测STAT5a/b基因沉默前后STAT5a/b的mRNA表达变化;蛋白免疫印迹法检测STAT5a/b基因沉默前后的蛋白含量的变化;CCK-8检测T细胞RNA干扰前后增殖率的变化;流式技术检测T细胞RNA干扰前后细胞增殖周期及早期凋亡率的变化.结果 (1)哮喘小鼠气道病理结果显示明显炎症改变.(2)哮喘组小鼠脾脏淋巴细胞STAT5a/b mRNA表达量较正常组小鼠明显增高(T值分别为11.71、33.04,均P＜0.05).(3)与空白对照组比较:特异性siRNA转染哮喘小鼠T细胞后,STAT5a和STAT5b沉默组的mRNA表达明显降低(T值分别为35.014、14.553,均P＜0.01);STAT5a和STAT5b沉默组蛋白表达也明显降低(T值分别为- 10.958、- 14.706,均P＜0.01);STAT5a和STAT5b沉默组T细胞增殖率明显降低(T值分别为8.692、10.540,均P＜0.01);STAT5a和STAT5b沉默组增殖期T细胞均明显降低(T值分别为-6.975、-5.567,均P＜0.05);STAT5a和STAT5b沉默组T细胞凋亡率明显升高(T值分别为-6.404、-6.038,均P＜0.05).结论 RNA干扰能特异性降低哮喘小鼠STAT5 a/b表达,抑制T细胞的增殖并促进T细胞凋亡.     

活化的类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Toll样受体4诱导Th17细胞分化

目的 研究类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs) Toll样受体4(TLR4)通过诱导Th17细胞分化参与RA疾病发生发展的意义.方法 采集22例RA患者和20名健康对照外周血,流式细胞术检测Th17细胞频率,脂多糖刺激PBMCs 2 d,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测PBMCs TLR4 mRNA水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量.收集上清液与CD4+脐带血单个核细胞(CBMCs)培养3d,RT-qPCR检测CBMCsIL-17 mRNA水平.ELISA检测上清液IL-17含量.统计学处理采用成组t检验.结果 与健康对照组比较,RA患者Th17细胞频率[(0.53±0.14)％与(1.57±0.68)％]、TLR4 mRNA显著升高(P均＜0.01);PBMCs经脂多糖刺激后,RA患者TLR4 mRNA升高3.5倍,而健康对照组下降到0.11倍;RA患者PBMCs产生的IL-6、TNF-α较健康对照组明显增加(P＜0.01);RA患者PBMCs上清液诱导CD4+CBMCs IL-17 mRNA水平、IL-17含量与健康对照组相比均显著升高(P＜0.01);而未经脂多糖刺激,2组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RA患者PBMCs的TLR4表达及对脂多糖的刺激的反应性增加,且具有较强的诱导Th17细胞分化能力.     

CD4+CD25+T细胞延长同种异体胰岛移植物存活

探讨CD4+ CD25+调节性T细胞作为细胞疫苗抑制小鼠同种异体胰岛移植物排斥反应的作用,采用免疫磁珠分离技术分选CD4+ CD25+调节性T细胞联合BALB/cByJ小鼠同种异体胰岛移植.结果 显示,CD4+ CD25+调节性T细胞可明显延长同种异体移植物的存活时间.     

骨髓源性间充质干细胞联合来氟米特对小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用

目的 探讨骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)在体外联合来氟米特(LEF)对小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用.方法 直接贴壁筛选法分离培养小鼠BMSCs,流式细胞分析(FCM)鉴定BMSCs的纯度.用EZ-SepTMm Mouse 1X分离异体BALB/c小鼠的脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A(ConA)诱导的同时,先经LEF处理,洗去LEF后,脾淋巴细胞再和BMSCs共培养.分组:A组:脾淋巴细胞;B组:脾淋巴细胞+BMSCs;C组:LEF处理的脾淋巴细胞;D组:LEF处理的脾淋巴细胞+BMSCs.用四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测各组T淋巴细胞的增殖情况,流式细胞术分析各组T淋巴细胞的活化及凋亡情况,定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组T淋巴细胞的白细胞介素(IL)-2、IL-10基因水平.结果 在体外,BM-SCs处理组(B组)T淋巴细胞的A570 nm值为0.578±0.042,LEF处理组(C组)A570 nm值为0.5024±0.040,两组A570 nm值均显著低于对照组(A组)A570 nm值为0.778±0.035(P<0.01).BMSCs联合LEF组(D组)A570 nm值为0.218±0.033,显著低于BMSCs处理组及LEF处理组(P<0.01). BMSCs联合LEF对CD3+CD69+、CD3+CD28+表达、IL-2基因表达均无明显影响.BMSCs单独或联合LEF组T淋巴细胞凋亡率分别为(2.29±0.32)%、(4.22±0.98)%,较A组T淋巴细胞凋亡率(8.08±1.20)%均明显下降.BMSCs处理组和LEF处理组T淋巴细胞IL-10基因相对表达分别为:0.098±0.039、0.054±0.022明显低于A组(IL-10基因相对表达为1.000)(P<0.01),MSCs联合LEF组IL-10基因相对表达为:0.023±0.015,显著低于BMSCs处理组及LEF处理组(P<0.01).结论 BMSCs联合LEF对小鼠T淋巴细胞有一定程度的协同免疫调节作用.     

慢性乙型肝炎患者CD3+CD56+淋巴细胞及其表型与病情的关系

目的 探讨CD3+CD56+淋巴细胞与慢性乙型肝炎(CHB)患者病情变化和转归的关系.方法 CHB患者53例,HBV携带者17例,19名健康体检者为对照组.研究对象均抽取外周血2～3ml,采用流式细胞技术测定CD3+CD56+淋巴细胞,并进一步分析CD3+CD56+淋巴细胞表面CD4,CD8、T细胞抗原受体(TCR)V α 24,TCR α/β以及TCR γ/δ的表达.结果CHB组CD3+CD56+淋巴细胞为7.4%±4.6%,慢性HBV携带者组为4.5%±3.5%,对照组为4.4%±3.7%,CHB组CD3+CD56+淋巴细胞明显升高.3组人群CD3+CD56+淋巴细胞TCR V α 24的表达,差异无统计学意义.慢性HBV携带者组CD3 CD56+细胞表达的TCR V α 24为2.8%±1.4%,明显高于对照组1.7%±1.0%.CHB组CD3+CD56+细胞CD8和TCRα/β的表达分别为61.9%±16.8%和68.1%±16.9%,对照组为49.2%±15.6%和56.4%±17.9%,CHB组均明显高于对照组.CHB组和HBV携带者组TCR γ/δ的表达,分别为29.6%±15.4%和30.5%±14.8%,CHB组和HBV携带者明显低于对照组41.4%±19.4%.CHB重度患者CD3+CD56 1细胞CD8和TCR α/β的表达分别为69.0%±14.0%和76.1%±12.9%,CHB中度患者CD8的表达为66.4%±14.9%,均明显高于CHB轻度患者51.4%±16.2%和62.1%±14.6%. 结论 慢性乙型肝炎的活动可能与CD3+CD56+淋巴细胞的CD8高表达有关.     

间充质干细胞体外对ITP患者T淋巴细胞分泌功能的影响

目的： 体外观察间充质干细胞（MSCs）对特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者T淋巴细胞分泌细胞因子功能的影响。方法: 采用Ficoll分离和体外贴壁、传代培养,扩增出骨髓MSCs;通过Ficoll分离法和尼龙棉柱法获取ITP患者外周血T淋巴细胞。以经丝裂霉素（MMC）处理后不同数量（2×103、1×104、5×104 cells/well）的MSCs作为基底层细胞,接种体外分离纯化的异体ITP患者T淋巴细胞,分别于2 d、4 d、6 d后各自收集培养上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法动态测定T淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)水平的变化。结果: ITP患者T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ较正常人高(P<0.05),IL-4、IL-10较正常人低(P<0.05)。MSCs可显著抑制ITP患者或正常对照组T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ(P<0.05),且随MSCs数量的增加,抑制增强(P<0.05),共培养4 d、6 d时作用明显强于2 d时(P<0.05);MSCs可促进ITP患者T淋巴细胞分泌IL-4、IL-10 (P<0.05),且随MSCs量的增加,促进作用增强(P<0.05),对IL-10的作用随时间延长而增强(P<0.05),但对IL-4的作用在培养第2 d、4 d、6 d时无显著差异(P>0.05);在正常对照组,当MSCs数量>1×104可以促进T淋巴细胞分泌IL-4 与IL-10 (P<0.05),且随MSCs数量的增加,作用增强(P<0.05),共培养4 d、6 d时作用明显强于2 d时(P<0.05)。结论: MSCs能够在体外调节ITP患者辅助性T细胞1 (Thl)和辅助性T细胞2 (Th2)反应平衡,可使ITP患者Th1极化状态部分改善。     

槲皮素对小鼠T细胞体外活化的抑制作用

目的:通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD69表达的影响,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法:分离小鼠淋巴结细胞,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养,分别于2、6、24h收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞仪对T细胞的CD69分子表达情况进行分析并计算抑制率。结果:槲皮素(终浓度10μmol/L)对未受刺激的T细胞CD69表达百分率无明显影响,而经佛波醇酯(PDB)及刀豆蛋白A(ConA)活化同时加入槲皮素的T细胞CD69表达百分率在2h、6h及24h均显著下降(P＜0.01)。槲皮素对PDB的抑制率随作用时间延长而明显下降,对ConA的抑制率平缓而持久。结论:槲皮素对PDB、ConA活化的T淋巴细胞均显示明显的抑制效应,表明该药可能作用于T细胞活化信号传递通路蛋白激酶Cθ或其下游部位,并且,这种抑制效应表现出一定的可逆性。     

特异性细胞因子对T辅助17细胞和T调节性细胞表达的调节作用

目的 探讨多种细胞因子包括转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素2(IL-2)对CD+4T淋巴细胞的分化调节作用.方法 将人外周血T淋巴细胞、鼠脾脏T淋巴细胞在不同的刺激条件下进行体外培养,采用流式细胞仪分析活化T淋巴细胞中CD+4IL-17+T辅助17细胞(Th17细胞)、C+4IL-17+T淋巴细胞、CD+4CD+25FOXP+3T调节性细胞(Treg细胞)的表达情况.结果 鼠脾脏T淋巴细胞培养液中有TGF-β存在时可促进Treg细胞、rh17细胞和CD+8;IL-17+T淋巴细胞分化,表达水平分别为(7.8±2.2)%、(12.6±3.1)%、(10.1±2.6)%.无细胞因子培养的同类细胞为实验对照组,表达水平分别为(4.8±0.6)%、(1.7±0.5)%、(1.0±0.4)%,差异均有统计学意义(q=4.09、8.80、9.61,P<0.05或P<0.01).TGF-β与IL-6细胞因子共同存在时可促进Th17和CD+8IL-17+T淋巴细胞分化,表达水平分别为(17.8±5.3)%、(15.0±4.2)%,而分化受抑制的Treg细胞的表达水平为(4.I±1.2)%,与TGF-β组同类细胞表达水平比较差异均有统计学意义(q=5.03、5.17、5.04,P均<0.01).在TGF-β刺激的T淋巴细胞中加入IL-2细胞因子可使Th17细胞、CD+8;IL-17+T淋巴细胞表达减少,同时伴有Treg细胞表达量的增加;在加入抗IL-2后结果相反,即Th17细胞、CD+8IL-17+T淋巴细胞表达水平增加,Treg细胞表达水平减少.人外周血T淋巴细胞上Th17、CD+8IL-17+、Treg细胞表达水平变化趋势与鼠脾脏淋巴细胞相似.结论 不同细胞因子对于调控Th17细胞和Treg细胞之间的平衡起着十分重要的作用.     

免疫监测研究与应用中值得关注的几个问题

免疫监测是免疫检验中的重要组成部分,包含从细胞到生物分子等多种指标.在此重点讨论3个问题:首先,T淋巴细胞是所有免疫应答的中心环节,对其进行检测,对了解免疫相关疾病非常重要.在临床检验中应根据实验室条件(如流式细胞仪)和检测目的 (如抗原特异性T淋巴细胞数量或功能)选择不同方法.其次,自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要指标;有些自身抗体甚至可预测疾病的发生,越来越多研究表明,肿瘤患者中存在多种自身抗体,这些自身抗体有可能对肿瘤诊断、治疗肿瘤靶分子的筛选提供帮助.另外,检测细胞因子是了解疾病免疫学机制的重要途径;细胞因子检测有助于判断疾病活动程度,但不具有器官或组织特异性;应加强细胞因子检测的质量控制,以提高其在临床检验中的应用质量.